[發(fā)明專利]一種NK細胞的高效基因轉導方案

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211080597.6
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN115466726B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發(fā)明（設計）人: 賈興龍;韓瑞勝;張曉艷;黃園園;楊月峰;郭雷鳴;王立燕
• 申請（專利權）人: 北京景達生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61K45/06;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/12;A61P37/02
• 代理公司: 北京預立生科知識產(chǎn)權代理有限公司 11736
• 代理人: 朱萍

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和生物技術領域，具體涉及一種NK細胞的高效基因轉導方案。具體地，提供了一種提高進行病毒轉導時的轉導效率的細胞處理方法，所述方法包括活化和/或促轉導的步驟，所述活化所使用的培養(yǎng)基中至少含有細胞因子IL?2、IL?15和IL?1β，所述促轉導的培養(yǎng)基中含有Polybrene和/或BX795。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和生物技術領域，具體涉及一種NK細胞的高效基因轉導方案。

背景技術

自然殺傷細胞(Natural?Killer，NK)來源于CD34⁺淋巴祖細胞，具有分泌干擾素γ(Interferonγ，IFN-γ)的能力，是人體抵御感染或異常細胞的第一道防線。NK細胞不僅是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，也在適應性免疫激活過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，NK細胞活化是誘導“CD4⁺T淋巴細胞非依賴性細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic?T-lymphocytes，CTLs)”的關鍵環(huán)節(jié)，其主要機制是：通過激活NK細胞產(chǎn)生IFN-γ，進一步激活DC產(chǎn)生IL-12，最終誘導CTLs，進而發(fā)揮腫瘤殺傷和監(jiān)視復發(fā)等作用。隨著NK細胞基礎研究的不斷深入和治療技術的不斷提升，不同來源的NK細胞，如外周血、臍帶血、胚胎干細胞、誘導多能干細胞、腫瘤細胞等來源的NK細胞被廣泛應用于基礎和臨床研究中。與T淋巴細胞相比，NK細胞具有抗原譜更寬、無MHC限制性、不引發(fā)細胞因子風暴等特點，越來越受到研究者的關注。

嵌合抗原受體T淋巴細胞(Chimeric?antigen?receptors-modified?T?cells，CAR-T)在血液腫瘤中的巨大成功，極大地推動了免疫細胞治療的發(fā)展。至今，全球已有7款CRA-T產(chǎn)品獲批上市，用于血液腫瘤的治療。但是，在臨床治療中，CAR-T的局限性也逐漸顯現(xiàn)，如對實體瘤的療效不佳；需要個體化制備，制備周期長；易產(chǎn)生神經(jīng)毒性和細胞因子風暴造成安全隱患等。近年來，采用與CAR-T相似的策略制備CAR-NK細胞，在基礎和臨床研究中均取得了重大突破。其主要的優(yōu)勢包括：(1)無MHC限制，異體使用基本不會產(chǎn)生移植物抗宿主病(Graft?versus?host?disease，GVHD)，可制備“貨架”產(chǎn)品；(2)殺傷過程主要分泌IFN-γ、白介素(Interleukin，IL)-3和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage?colony-stimulating?factor，GM-CSF)等，腫瘤壞死因子α(Tumor?necrosisfactor，TNF-α)、IL-6等表達水平低，細胞因子風暴和神經(jīng)毒性風險低；(3)除CAR介導的細胞殺傷外，還可通過CAR非依賴的途徑，多機制發(fā)揮抗腫瘤效應；(4)NK細胞低表達PD1，有望突破實體瘤免疫抑制微環(huán)境。

與其他來源NK細胞相比，外周血來源NK細胞具有CD16表達水平高、細胞殺傷活性強等特點，是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(Antibody-dependent?cell-medicatedcytotoxicity，ADCC)的理想效應細胞。然而，基于終末分化NK細胞的抗病毒特性，利用重組慢病毒進行基因轉導存在諸多困難。重組慢病毒可通過識別靶細胞表面的低密度脂蛋白(Low-Density?Lipoprotein，LDL)受體，進而進入細胞，但是由于NK細胞LDL受體表達低，因此，未經(jīng)改造的重組慢病毒對NK細胞的基因轉導效率低。

發(fā)明內(nèi)容

為解決重組慢病毒對NK細胞轉導效率低的問題，本發(fā)明提供了一種可顯著提升NK細胞基因轉導效率的技術方案，解決基于VSV-G的重組慢病毒對NK細胞基因轉導效率低的技術難題。

具體提出以下技術方案：

產(chǎn)品

一方面，本發(fā)明提供了一種NK細胞的促轉導培養(yǎng)基，所述促轉導培養(yǎng)基中含有促轉導試劑，所述促轉導試劑包括Vectofusin-1、Polybrene、BX795、Dextran和Rosuvastatin中的1種或2種。