[發(fā)明專利]一種NK細(xì)胞的高效基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方案

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211080597.6
• 申請(qǐng)日: 2022-09-05
• 公開（公告）號(hào): CN115466726B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈興龍;韓瑞勝;張曉艷;黃園園;楊月峰;郭雷鳴;王立燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京景達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61K45/06;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/12;A61P37/02
• 代理公司: 北京預(yù)立生科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11736
• 代理人: 朱萍

1.一種提高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的細(xì)胞處理方法，所述方法包括NK細(xì)胞活化處理，所述活化處理的步驟是：采用僅含有2000U/mL的IL-2、100ng/ml的IL-15和100U/mL的IL-1β的X-VIVO15培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，活化2天；

所述方法還包括取經(jīng)過(guò)活化處理的NK細(xì)胞，采用僅含有2000U/mL的IL-2和100ng/ml的IL-15的X-VIVO15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至2?.0×10⁶細(xì)胞/ml，按照2?.0ml/孔接種6孔板，依次加入重組慢病毒和0.1μM?的BX795，培養(yǎng)4小時(shí)；補(bǔ)加2ml僅含有5％的滅活血漿、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和100IU/mL的IL-12的X-VIVO15培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；收集細(xì)胞后再使用僅含有2％的滅活血漿、2000U/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和20ng/ml的IL-18的X-VIVO15培養(yǎng)基培養(yǎng)；

所述NK細(xì)胞是經(jīng)以下處理得到的：

（1）培養(yǎng)瓶預(yù)處理：將僅含有CD137為8μg/mL，CD28為8μg/mL和CD3為?8μg/mL的生理鹽水溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并使溶液充分在瓶底分散，4℃過(guò)夜；

（2）獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞；

（3）誘導(dǎo)NK細(xì)胞：將步驟（2）獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞按照2?.0×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞濃度，采用僅含2000IU/ml的IL-2、100ng/mL的IL-15、100IU/mL的IL-12、5μg/ml的CD137和10％滅活血漿的X-VIVO15培養(yǎng)基培養(yǎng)，將20ml細(xì)胞接種到經(jīng)過(guò)步驟（1）預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中；

（4）第一次補(bǔ)液：在第3天，向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加僅含有5％的滅活血漿、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和100IU/mL的IL-12的X-VIVO15培養(yǎng)基20ml；

（5）第二次補(bǔ)液：在第5天，向培養(yǎng)瓶中繼續(xù)補(bǔ)加僅含有5％的滅活血漿、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和100IU/mL的IL-12的X-VIVO15培養(yǎng)基80ml；

所述重組慢病毒的感染強(qiáng)度為1MOI或3MOI；所述重組慢病毒是基于VSV-G的重組慢病毒。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述NK細(xì)胞的處理還包括步驟（6）第三次補(bǔ)液：在第7天，向培養(yǎng)瓶中繼續(xù)補(bǔ)加僅含有5％的滅活血漿、2000IU/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15和100IU/mL的IL-12的X-VIVO15培養(yǎng)基120ml。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，所述重組慢病毒的純化方式是柱層析純化。