[發明專利]一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應用

在審

• 申請號: 202211079655.3
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN116042571A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 殷雷;周進;陳鵬;王宏建;劉歡;方嘉凌
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113;C12N15/861;C12N15/867;C12N5/10;C12N7/01
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 江慧

本發明提供了一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應用，所述Cas12a變體為LbCas12a?K538R，氨基酸序列如SED?ID?NO.2所示。本發明首次通過蛋白改造，獲得Cas12a變體，使Cas12a的PAM識別相比較對應野生型更嚴格，從而降低脫靶效應；所述三種Cas12a變體能夠在crRNA的介導下定點對真核生物基因組進行基因編輯且具有更低的脫靶效應，三種Cas12a變體的發現進一步擴大了基因編輯工具的種類。

本發明專利申請是申請號為“CN202110578385.X”的發明專利的分案申請，原申請的申請日為“2021年5月26日”，申請號為“CN202110578385.X”，發明名稱為“一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應用”。

技術領域

本發明涉及基因編輯技術領域，特別涉及一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應用。

背景技術

自2013年以來，基因編輯技術取得了突破性進展，此項技術已經在基礎科學研究、醫藥、臨床、生物技術等許多領域引起了新的變革。除了具有代表性的Cas9系統之外，Cas12，又名Cpf1，作為又一種被發現的具有基因編輯效應的CRISPR系統新成員，極大的擴大了基因編輯系統靶點的可編輯范圍，相比于Cas9系統，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，為其介導多基因編輯提供了相比與Cas9系統更為便捷高效的編輯能力。除此之外，相比于Cas9的向導RNA，Cas12a的向導RNA組成更為簡單，設計更為方便。

2015年，張峰團隊首次發現了Cas9系統之外的另外一種具有基因編輯能力的新成員，Cas12a，又名Cpf1，將其劃分到CRISPR系統2類V型中。相比于Cas9系統，Cas12a的編輯效率與Cas9的效率相當，在有些靶點低于Cas9。Cas12a的脫靶率極低，相比于Cas9脫靶率高的特性，Cas12a是一種安全的基因編輯工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易發生同源重組修復，這也為基因的定點插入和修復提供了更好的工具。在向導RNA的加工方面，Cas12a具有明顯的優勢，僅僅只需要Cas12a本身就能夠完成對前提RNA的加工，而Cas9系統則需要RNaseIII的加工，這極大地促進Cas12a在多基因編輯上的應用。在PAM的識別上，Cas12a識別5’-TTTN-3’或5’-KYTV-3’，Cas9則識別5’-NGG-3’。

因此，Cas12a作為一種新型基因編輯工具，與Cas9系統一道，為科學研究和疾病的治療提供了有力的工具。基于對目前已有的Cas12a的研究，為應對將來各種情況下的基因編輯事件，發現更多的具有一定特性的Cas12a變體是一件具有重要意義的事情。

發明內容

本發明目的是提供一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應用，該Cas12a變體包括Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R，其在體外比對應野生型PAM識別更嚴格；且在體內脫靶效應更低。

在本發明的第一方面，提供了一種Cas12a變體，所述Cas12a變體包括如下中的至少一種：

Lb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分別如SED?ID?NO.1所示；

LbCas12a-K538R，氨基酸序列分別如SED?ID?NO.2所示；

AsCas12a-K548R，氨基酸序列分別如SED?ID?NO.3所示。

在本發明的第二方面，提供了一種重組表達載體，所述重組載體表達所述的Cas12a變體。

進一步地，所述重組表達載體包括質粒載體、病毒載體和噬菌體載體中的一種。

在本發明的第三方面，提供了一種重組菌或重組細胞系或重組病毒，包含所述的重組表達載體。