[發明專利]一種利用預換液技術提高梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色效果的方法

在審

• 申請號: 202211079148.X
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN115615785A
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 吳巨友;朱曉璇;湯超;王鵬;張紹鈴
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發明公開了一種利用預換液技術提高梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色效果的方法，該方法包括采集花粉、花粉的體外培養、使用預換液技術對花粉進行固定和封閉、抗體孵育、觀察及測定等步驟。該方法不涉及傳統的染料與多糖共價結合的技術，而是使用預換液技術及抗體——抗原特異結合的原理對梨花粉管細胞壁甲酯化果膠進行染色，具有安全高效、特異性強、破損率低、易于觀察等優點。該方法對梨花粉管的甲酯化果膠的檢測，有助于梨花粉生活力的測定以及對花粉管生長代謝等生殖生理過程的研究，同時也為其他植物組織或花粉管甲酯化果膠染色提供方法參考。

技術領域

本發明屬于植物免疫組化技術領域，涉及一種梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色的方法，具體涉及一種利用預換液技術降低梨花粉管破損率，細胞固定液固定花粉管細胞、牛血清蛋白封閉、抗體與抗原特異結合的梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色的方法。

背景技術

植物花粉管是一種典型的尖端生長細胞，它的快速生長依賴于花粉管細胞壁機械強度和胞內膨壓間的相互平衡。果膠是一種富含半乳糖醛酸的多糖，是花粉壁和花粉管壁的主要構成成分。果膠在細胞高爾基體內合成后，以高度甲酯化的形式通過囊泡運輸至細胞壁，隨著花粉管的生長再由果膠甲酯酶不同程度的去甲酯化。其中甲酯化的果膠存在于花粉管頂端的細胞壁中，使之具有一定的延展性；而去甲酯化果膠則存在于花粉管胞壁的其余部分，能夠與游離的鈣離子結合形成“蛋盒狀”交聯結構，從而提高胞壁的機械硬度。因此，花粉管細胞壁中的甲酯化果膠和去甲酯化果膠的相對含量調控著花粉管的正常生長。

傳統的細胞壁果膠染色常使用與胞壁多糖共價結合的染料，如碘化丙啶(PI)染料。然而碘化丙啶不僅對花粉管自身有毒害性，而且對人體也具有強致癌性；同時只能對活細胞進行染色，且背景色較高，熒光強度隨孵育時間而減弱，不利于觀察。梨花粉管是一種特殊的植物細胞，如操作不當或外界滲透壓驟然變化，極易使之破裂，導致細胞內容物流出，污染染色背景，不利于觀察。因此，建立一套適用于梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色的方法，有助于更好的研究在外界環境因素及激素、多肽等處理下甲酯化果膠含量的變化，從而促進對梨花粉管生長代謝等生殖生理過程的研究。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用預換液技術提高梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色效果的方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種利用預換液技術提高梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色效果的方法，該方法包括以下步驟：

(1)花粉采集：采集大蕾期梨花藥并干燥；可以采用鹵素燈絲管照射或干燥硅膠陰干。

(2)花粉培養：分離花藥中的花粉，將分離的花粉加入花粉培養基中避光培養；

(3)花粉管的收集及預換液：離心收集花粉管，去除花粉培養基，使用緩沖液對收集的花粉管進行預換液處理；

(4)固定花粉管：向步驟(3)中最終收集的花粉管中加入細胞固定液，輕柔重懸，于22-25℃固定25-30min；

(5)花粉管的收集及預換液：離心收集花粉管，去除細胞固定液，使用緩沖液對收集的花粉管進行預換液處理；

(6)封閉：向步驟(5)中最終收集的花粉管中加入封閉液，輕柔重懸，于22-25℃封閉25-30min；所述的封閉液為1％w/v的BSA溶液；

(7)花粉管的收集及洗滌：離心收集花粉管，去除封閉液，使用0.1％w/v的BSA溶液輕柔重懸花粉管，洗滌后離心棄廢液，重復2-3次，收集花粉管；

(8)孵育一抗：向步驟(7)中最終收集的花粉管中加入0.1％w/v的BSA溶液稀釋后的一抗，輕柔混勻，于4-8℃靜置孵育6-8h；

(9)花粉管的收集及洗滌：離心收集花粉管，去除孵育液，使用0.1％w/v的BSA溶液輕柔重懸花粉管，洗滌后離心棄廢液，重復2-3次，收集花粉管；