[發明專利]一種利用預換液技術提高梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色效果的方法

在審

• 申請號: 202211079148.X
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN115615785A
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 吳巨友;朱曉璇;湯超;王鵬;張紹鈴
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種利用預換液技術提高梨花粉管細胞壁甲酯化果膠染色效果的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)花粉采集：采集大蕾期梨花藥并干燥；

(2)花粉培養：分離花藥中的花粉，將分離的花粉加入花粉培養基中避光培養；

(3)花粉管的收集及預換液：離心收集花粉管，去除花粉培養基，使用緩沖液對收集的花粉管進行預換液處理；

(4)固定花粉管：向步驟(3)中最終收集的花粉管中加入細胞固定液，輕柔重懸，于22-25℃固定25-30min；

(5)花粉管的收集及預換液：離心收集花粉管，去除細胞固定液，使用緩沖液對收集的花粉管進行預換液處理；

(6)封閉：向步驟(5)中最終收集的花粉管中加入封閉液，輕柔重懸，于22-25℃封閉25-30min；所述的封閉液為1％w/v的BSA溶液；

(7)花粉管的收集及洗滌：離心收集花粉管，去除封閉液，使用0.1％w/v的BSA溶液輕柔重懸花粉管，洗滌后離心棄廢液，重復2-3次，收集花粉管；

(8)孵育一抗：向步驟(7)中最終收集的花粉管中加入0.1％w/v的BSA溶液稀釋后的一抗，輕柔混勻，于4-8℃靜置孵育6-8h；

(9)花粉管的收集及洗滌：離心收集花粉管，去除孵育液，使用0.1％w/v的BSA溶液輕柔重懸花粉管，洗滌后離心棄廢液，重復2-3次，收集花粉管；

(10)孵育二抗：向步驟(9)中最終收集的花粉管中加入用0.1％w/v的BSA溶液稀釋后的二抗，于22-25℃避光孵育35-45min；將孵育完畢的花粉管用0.1％w/v的BSA溶液輕柔重懸，洗滌后離心棄廢液，重復1-2次，收集花粉管，完成對梨花粉管細胞壁甲酯化果膠的染色。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉培養基的配方為：10％w/v蔗糖，0.01％w/v H₃BO₃，0.03％w/v Ca(NO₃)₂，0.58％w/v MES(α-磺基甲酯磺酸鈉)，10％w/v PEG(聚乙二醇)，Tris堿調至pH值為6.2-6.3。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞固定液的配方為：4％w/v多聚甲醛，50mM PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)，1mM EGTA(乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5mMMgCl₂，pH 6.7-7.0。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1％w/v的BSA溶液和0.1％w/v的BSA溶液均用所述的緩沖液稀釋。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的一抗為Anti-Pectic

polysaccharide(Homogalacturonan)[LM20]抗體，稀釋比為1:10-50。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二抗為Goat anti Rat IgG/IgM(H/L)抗體(FITC)，稀釋比為1:250-500。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中將分離的花粉加入花粉培養基中避光培養的培養條件為：于23-25℃，100-120rpm的搖床中避光培養2-3h。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)和(5)中對收集的花粉管進行預換液處理的步驟各自獨立的為：用緩沖液輕柔重懸所收集的花粉管，洗滌3-5min，2000-3000rpm離心2-3min，棄廢液，收集花粉管，重復2-3次；步驟(7)、(9)和(10)中所述洗滌后離心棄廢液的過程各自獨立的為：洗滌3-5min，2000-3000rpm離心2-3min，棄廢液。

9.根據權利要求1、4或8所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的配方為：135mM NaCl，3.2mM Na₂HPO₄，1.3mM KCl，0.5mM KH₂PO₄，10％w/v PEG(聚乙二醇)，pH 7.0-7.5。