[發明專利]一種主動結構光照明的超分辨顯微成像方法及系統

在審

• 申請號: 202211076269.9
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN115308184A
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 梁永;文剛;陳曉虎;金鑫;王林波;李輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 朱炳斐

本發明公開了一種主動結構光照明的超分辨顯微成像方法及系統。提出時空聯合強度調制方法，可對照明樣本的激發光進行空間任意強度的調控，且在不改變入射光相干性的前提下，實現高調制度的主動結構光照明超分辨成像?；谏鲜稣{制方法可實現將輸入的非均勻高斯分布照明調制成均勻的平頂照明，滿足基于熒光強度定量分析的應用需求；根據樣本空間強度分布特征主動調整照明光強，滿足高動態、低光照劑量成像需求；用戶自定義照明區域，滿足光刺激、熒光漂白恢復應用需求。本發明在不損失SIM時空分辨率的前提下，可有效提高SIM的成像動態范圍，減少光照劑量，滿足細胞亞結構及其相互作用對百納米以下超分辨、極低光照劑量、高動態范圍的成像需求。

技術領域

本發明屬于熒光顯微成像技術領域，特別是一種主動照明與結構光照明復合的超分辨顯微成像系統。

背景技術

細胞是一個高度復雜的動態系統，其內部通過膜結構的區隔化形成多種功能迥異的數十種細胞器。這些細胞器的相互作用是維持細胞功能、決定細胞命運的關鍵。對這些細胞器及其相互作用的研究需要進行百納米以下高分辨率、極低光照劑量、高動態范圍、大視場均勻照明的活細胞成像。

在獲取大視場均勻照明的研究中，光束整形器直接將高斯傳播的光束轉換為平頂光束，利用一對非球面透鏡組，第一個透鏡均勻的重新分配高斯光束，第二個透鏡重新準直，從而產生平場照明。但基于折射光束整形器的工作距離有限，對表面加工質量和光學排列有嚴格的要求。光波導可在非常大的視場下提供均勻的照明，但由于它們工作在全內反射模式下，照明限制在蓋玻片附近，無法實現切換照明角度實現不同深度照明。且固定的照明尺寸，不能和相機的成像視場進行匹配照明，全玻片照明對細胞樣本造成不必要的光損傷。此外，經典方法包括使用一對微透鏡陣列或者多模光纖，為了減少激光散斑，在系統中加入了散斑減速器或者振動光纖，但降低了光束的空間相干性，不適用于全內反射照明。ASTER本質上是一種混合掃描寬場照明裝置，其按照特定的模式掃描高斯光束，以時間平均的方式提供平頂照明，從而可以在比較寬的視場范圍內掃描出均勻照明場。然而，上述平場照明方法只能應用在基于單分子定位的超分辨顯微鏡中，比如PALM、STORM，其向基于多束光干涉產生余弦分布條紋的結構光照明顯微鏡(SIM)轉化中仍受到限制，原因在于在對入射的非均勻高斯光斑進行調制時，要保障多光束之間頻率相同、相位差恒定、偏振方向一直，以致在樣品面干涉形成高調制度的照明條紋。

在拓展顯微成像系統動態范圍及減少光照劑量的研究中，Vinergoni等將攝影學中廣泛應用的多曝光融合技術和基于點掃描的雙光子成像技術相結合，并將其應用于內場景大動態范圍的神經細胞成像中。但是連續多次曝光采集不僅增加了光照劑量，且降低了成像速度。為了克服多曝光的缺陷，發展出多探測同時成像技術，通過對同一場景進行多級分光成像，同時采集不同曝光量的圖像。然而由于采用多個成像光路同時探測，需要對不同的探測器進行校準，光學系統復雜且成本高。由此發展出主動照明技術，在成像系統中加入聲光調制器，空間上單像素地對照明光場進行調控，這不僅提高了動態范圍，而且減少了光照劑量。Hoebe等為了解決共聚焦顯微鏡有限的動態范圍、光漂白及光毒性問題，研制出照明光劑量空間上可調控的顯微成像技術，且在Nikon C1共聚焦顯微鏡上得到應用。實驗驗證，此成像技術不僅可以將動態范圍提高2倍，而且可將光照劑量降低5倍，有效延長活細胞的存活時間。然而，基于共聚焦、雙光子的低光照劑量、高動態成像方法，其分辨率受到光學衍射極限的限制。在使用大數值孔徑物鏡的情況下，橫向極限分辨率約為200nm，軸向分辨率為500nm。此外，基于點掃描成像模式，光漂白和光毒性嚴重且成像速度慢，無法滿足活細胞動態成像需求。