[發明專利]一種BDDE修飾的透明質酸寡糖的分離方法

在審

• 申請號: 202211076202.5
• 申請日: 2022-09-05
• 公開（公告）號: CN115925765A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 陳玉娟;張天際;李紅梅;吳萬福;喬莉蘋;郭學平
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司;中國計量科學研究院
• 主分類號: C07H15/04
• 分類號: C07H15/04;C07H1/06;G01N30/88
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 賈波

本發明公開了一種BDDE修飾的透明質酸寡糖的分離方法，采用LC?HRMS聯用對BDDE交聯透明質酸的酶解寡糖進行分離，通過優化色譜類型與分離條件，能夠實現酶解液中不同形態修飾寡糖的有效分離，降低了離子化抑制對寡糖定量結果的影響，實現了更為準確的寡糖定量檢測。與現有GPC色譜柱、寡糖分離常用的二醇基親水色譜柱（Luna?Hilic）和硅膠親水色譜柱（BEH?Hilic）相比，本發明酰胺色譜柱（BEH?Amide）對代表性寡糖目標物具有更好的分離度以及檢測靈敏度，為修飾度的準確分析奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于檢測技術領域，具體地，涉及一種BDDE修飾的透明質酸寡糖的分離方法，還涉及BDDE交聯透明質酸修飾度的測定方法。

背景技術

透明質酸(Hyaluronic?acid，HA)是一種天然存在于動物細胞間質中的線性多糖，由葡萄糖醛酸與N-乙酰葡萄糖胺組成的雙糖單元重復連接形成，其化學結構為(-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-)_n，相對分子量從幾萬至上百萬不等。由于HA溶液具有較高的黏性、極強的保水能力與很好的生物相容性，近年來其在醫療和醫美領域中的應用愈發廣泛：眼科手術、骨關節黏液補充、真皮填充等過程中都會涉及到高分子量HA。

外源性HA進入人體后會被體內的透明質酸酶降解。為了提高HA的力學性能并延長其在人體內發揮作用的持續時間，可以通過共價交聯劑將HA糖鏈交聯形成三維網狀結構，這種網狀結構在水中溶脹形成HA水凝膠。HA水凝膠已成為一種重要的功能性材料，其機械和物理性能取決于交聯程度和交聯方式。研究表明，過高的修飾和交聯程度可能會影響HA水凝膠的生物相容性和安全性。為解析HA水凝膠結構與功能的對應關系，建立相關產品的質控標準，研究交聯參數的精確表征方法具有非常重要的意義。

1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)是目前最為常用的交聯劑，使用BDDE交聯獲得的HA水凝膠已被證明具有較高的生物相容性和低毒性。在堿性條件下，BDDE的環氧結構與HA分子上的羥基發生親核反應，形成1,4-丁二醇二(丙烷-2,3-二元醇)醚(BDPE)衍生物，反應式如下。BDDE和HA的結合方式有兩種，一種是BDDE兩端均與HA結合，這種稱之為交聯修飾，另一種是BDDE僅一端與HA結合，另一端游離，這種稱之為懸掛修飾。對于采用BDDE交聯劑制備的HA衍生物而言，盡管其具有相同的起始材料，但所得產品的物理性質可能具有很大差別，其物理性質的不同可歸因于關鍵結構參數的差異，例如i)起始材料(HA)的分子量和多分散性；ii)修飾程度；iii)交聯劑在HA上的取代位置等。

經BDDE交聯修飾的HA分子量大且在水中的溶解度差，在對其進行修飾度表征時，通常采用工具酶(透明質酸酶或硫酸軟骨素酶ABC等)將其降解為寡糖片段。受到BDDE交聯劑的影響，工具酶無法實現將交聯HA完全降解為HA二糖，產物中會出現多種分子量與修飾程度、修飾方式不同的寡糖片段(如圖1所示)。例如，2-B用來表示發生了懸掛修飾的二糖；2-B-2用來表示發生了交聯修飾的二糖。通過對不同寡糖結構進行相對定量分析，可以表征產品的修飾度與修飾方式。目前尚無交聯HA寡糖結構表征相關專利，楊彪等(楊彪,郭學平,臧恒昌,等.交聯透明質酸凝膠修飾度的測定方法研究進展[J].藥物生物技術,2015(2):4.)采用分子排阻色譜與質譜聯用的方法(GPC-MS)對寡糖片段進行相對定量分析，然而，該方法具有以下缺陷，導致寡糖定量與修飾度表征結果不準確：

1)GPC色譜柱根據目標物分子量大小不同實現分離。交聯HA酶解后產生的部分寡糖片段分子量接近，這些片段無法通過GPC實現有效分離，并出現洗脫時間重疊的現象。在電噴霧過程中，洗脫時間重疊的寡糖會發生離子化相互抑制，導致相關結構的定量結果比實際值偏低。

2)論文中采用低分辨質譜作為檢測器，只能測定出目標寡糖小數點后1位的質核比(m/z)，這可能導致目標寡糖的定量分析受到與其m/z相近的雜質干擾，影響定量結果的準確性。