[發明專利]一種BDDE修飾的透明質酸寡糖的分離方法在審
| 申請號： | 202211076202.5 | 申請日： | 2022-09-05 |
| 公開（公告）號： | CN115925765A | 公開（公告）日： | 2023-04-07 |
| 發明（設計）人： | 陳玉娟;張天際;李紅梅;吳萬福;喬莉蘋;郭學平 | 申請（專利權）人： | 華熙生物科技股份有限公司;中國計量科學研究院 |
| 主分類號： | C07H15/04 | 分類號： | C07H15/04;C07H1/06;G01N30/88 |
| 代理公司： | 濟南泉城專利商標事務所 37218 | 代理人： | 賈波 |
| 地址： | 250101 山東省濟*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 bdde 修飾 透明 寡糖 分離 方法 | ||
1.一種BDDE修飾的透明質酸寡糖的分離方法，其特征在于，所述分離方法包括以下步驟：
使用高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術對修飾的透明質酸寡糖進行分離，
其中，高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術中使用酰胺色譜柱，以流動相A和流動相B進行梯度洗脫，
流動相A為甲酸銨水溶液或乙酸銨水溶液，流動相B為甲酸銨的乙腈水溶液或乙酸銨的乙腈水溶液。
2.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，流動相A中，甲酸銨水溶液或乙酸銨水溶液中甲酸銨或乙酸銨的濃度均為5-10?mM。
3.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，流動相B中，甲酸銨的乙腈水溶液或乙酸銨的乙腈水溶液中，甲酸銨或乙酸銨的濃度均為5-10?mM，乙腈水溶液中乙腈濃度為90-95wt%。
4.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，液相色譜中色譜柱的柱溫為22-40℃。
5.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，液相色譜中使用的流速為0.2-0.3mL.min-1。
6.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述酰胺色譜柱為BEH?Amide色譜柱。
7.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術的質譜條件為：負離子掃描模式；鞘氣流速10-20?arb；輔助氣流速：?0-5?arb；噴霧電壓：3-4?KV；毛細管溫度：?250-350?℃；S-Lens?RF?Level：?30-70?%V。
8.一種BDDE交聯透明質酸修飾度的測定方法，其特征在于，所述測定方法包括以下步驟：
（1）酶解交聯透明質酸得到修飾的透明質酸寡糖；
（2）利用權利要求1-7中任意一項所述的BDDE修飾的透明質酸寡糖的分離方法對修飾的透明質酸寡糖進行分離；
（3）高效液相色譜-高分辨質譜分析后，根據被檢測到離子的化學式與其對應峰面積，按照各離子單同位素峰占比，計算得到全同位素峰峰面積和；對得到的寡糖結構進行歸類，將同一結構而不同價態離子、同一結構而不同加合物形態離子的寡糖歸為同一種結構的寡糖，計算歸類后的寡糖的峰面積，按照修飾度的公式進行修飾度計算；
修飾度=∑（含有BDDE寡糖結構的峰面積*該寡糖中BDDE個數）/∑（各寡糖結構的峰面積*該寡糖中HA二糖的重復次數）。
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