[發明專利]采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法

在審

• 申請號: 202211070148.3
• 申請日: 2022-09-02
• 公開（公告）號: CN115901984A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 杜平;嚴歡;楊雪;劉鵬;鐘麗君;劉瀟;何清;田麗梅;于謙;段盛松;李峰;王俊;盛澤君
• 申請（專利權）人: 華宇生物科技（騰沖）有限公司;華派生物工程集團有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/74;G01N30/88
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本發明公開了采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，涉及口蹄疫病毒樣顆粒抗原定量分析技術領域。本發明具體包括以下步驟：用自動梯度混合儀制備20%?45%的蔗糖梯度，將500μl口蹄疫病毒樣顆粒置與蔗糖梯度頂部；在10℃條件下以38000rpm離心3.5h分離病毒樣顆粒；將超速離心管和高效液相色譜儀相連，以色譜儀的泵頭為驅動力，檢測流速為0.28?ml/min；采用紫外和激光檢測器連續檢測蔗糖梯度溶液的光學信號，通過計算機軟件系統分析樣品的出峰面積；根據甲狀腺球蛋白標準品紫外吸收峰面積和蛋白濃度的回歸方程計算病毒樣顆粒的含量。本發明可用于口蹄疫病毒樣顆粒組裝效率測定及監測多種口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的抗原含量，間接評價疫苗效力。

技術領域

本發明屬于口蹄疫病毒樣顆粒抗原定量分析技術領域，特別是涉及采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法。

背景技術

口蹄疫是一種急性、熱性、高度傳染性疾病，自然宿主廣泛，能夠感染牛、豬、羊等牲畜和其他野生動物，嚴重威脅世界牲畜產業及動物產品國際貿易。滅活疫苗是目前使用的主要疫苗，在防控方面發揮了重要作用，但滅活疫苗在生產過程中動用活毒有散毒隱患，且不能區分感染動物和免疫動物（3B缺失的口蹄疫全病毒標記疫苗雖可進行感染動物和免疫動物的精準鑒別，但其生產還需動用活病毒），已呈現出不符合我國現階段口蹄疫防控要求的趨勢。

病毒樣顆粒由病毒的一種或多種結構蛋白組成，其進入免疫細胞和誘發免疫反應的機制均和全病毒相似，由于不存在核酸而無感染性。2021年9月，大腸桿菌系統表達、自組裝的由口蹄疫結構蛋白VP0、VP1和VP3組成的口蹄疫VLPs疫苗獲得國家一類新獸藥證書。病毒樣顆粒疫苗的優勢是生產不需動用活毒，生產成本低，生產效率高，并能區分感染和免疫動物，且免疫效力高于滅活疫苗，被行業認為是取代現有滅活疫苗的最有力候選者。

疫苗的保護效果主要取決于疫苗毒株與流行毒株的同源性以及疫苗中的抗原含量，病毒樣顆粒的含量是決定口蹄疫病毒樣顆粒疫苗質量和免疫效力的關鍵性因素。目前，還無有關口蹄疫病毒樣顆粒含量定量方法的相關報導，由于病毒樣顆粒結構和全病毒的相似性，可借鑒口蹄疫病毒的定量技術，但由于人工組裝口蹄疫病毒樣顆粒的不均一性，故不能全部套用口蹄疫病毒的定量技術。我國目前推廣的口蹄疫病毒粒子的定量方法主要有“尺寸排阻高效液相色譜柱測定口蹄疫抗原146S”及“蔗糖密度梯度離心定量口蹄疫146S”，由于口蹄疫病毒樣顆粒沒有核酸，其分子量小于全病毒，故在蔗糖中的浮密度也小于口蹄疫病毒，被成為75S，從理論上推斷口蹄疫病毒樣顆粒在尺寸排阻高效液相色譜柱技術和蔗糖密度梯度離心的出峰位置均要晚于全病毒。利用尺寸排阻高效液相色譜柱測定口蹄疫病毒樣顆粒含量時發現，在口蹄疫病毒出現的位置并沒有出峰，由于人工組裝口蹄疫病毒樣顆粒的不均一性，導致病毒樣顆粒和單體、聚集體的區分比較困難，且由于高效液相系統的高壓力對病毒樣顆粒的結構可能存在破壞，致使其檢測準確性受限。蔗糖密度梯度離心是分離病毒的一種經典方法，其作用條件相對溫和，但病毒樣顆粒的出峰位置與全病毒存在差異，故分離病毒樣顆粒的蔗糖梯度及條件與全病毒均有差異，而傳統的蔗糖密度梯度離心方法全部采用手工操作，重復性較差。

因此，有必要對現有技術進行改進，以解決上述技術問題。

發明內容

本發明的目的在于提供采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，蔗糖密度梯度超速離心法的作用條件溫和，對病毒樣顆粒的破壞較小，優化的蔗糖梯度和離心條件，使蔗糖密度梯度的分辨率更高，可將聚集體、病毒樣顆粒和單體及雜蛋白完全區分；高效液相色譜儀的特殊使用減少了壓力對病毒樣顆粒的破壞和人為主觀判斷對結果的影響，提高了檢測的敏感性、準確性，保證了結果的重復性。本方法可用于口蹄疫病毒樣顆粒組裝效率的測定及監測多種口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的抗原含量，間接評價疫苗效力。

為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明為采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，測定方法具體包括以下步驟；