[發明專利]采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法

在審

• 申請號: 202211070148.3
• 申請日: 2022-09-02
• 公開（公告）號: CN115901984A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 杜平;嚴歡;楊雪;劉鵬;鐘麗君;劉瀟;何清;田麗梅;于謙;段盛松;李峰;王俊;盛澤君
• 申請（專利權）人: 華宇生物科技（騰沖）有限公司;華派生物工程集團有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/74;G01N30/88
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• 代理人: 暫無信息

1.采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，其特征在于：測定方法具體包括以下步驟；

S1：用pH8.0的TNE緩沖液分別配制20%和45%的蔗糖溶液；取規格為4.5ml的超速離心管，通過梯度混合儀自帶的刻度尺對超速離心管進行標記；先將20%的蔗糖溶液加入超速離心管至標記處，再用長針頭將45%的蔗糖溶液從底部加入超速離心管至頂部；將裝有蔗糖梯度溶液的超速離心管至于梯度混合儀中，選擇20%-45%蔗糖梯度制備程序，連續工作90s，得20%-45%連續梯度的蔗糖溶液；

S2：取口蹄疫病毒樣顆粒組裝混合液，通過高速離心機以8000rpm離心3min，取上清液備用；先從制備好的蔗糖梯度溶液頂層吸棄400μl，再加入500μl上清液，在10℃條件下通過超速離心機以35000rpm離心3.5h，得離心樣品；

S3：用末端帶有15cm長針頭且管徑為0.5mm的管路將高效液相色譜儀的泵頭和外部超速離心管相連，打開高效液相色譜儀的泵送系統和紫外檢測系統，以45%的蔗糖溶液為流動相，平衡基線；

S4：將長針頭插入到含有離心樣品的超速離心管底部；打開泵系統，設定流速為0.28ml/min，檢測波長設定為280nm和259nm,色譜儀的電腦系統自動繪制濃度曲線，得目標峰的積分面積；

S5：將甲狀腺球蛋白標準蛋白用緩沖液在12.5-200μg/ml濃度范圍間配置成6個濃度梯度的標準溶液樣品；取標準溶液樣品0.5ml，代替口蹄疫病毒樣顆粒組裝混合液按步驟S1-S3進行操作后，將長針頭插入到含有標準溶液樣品的超速離心管的管底；打開泵系統，以0.28ml/min的流速運行，在280nm紫外波長下進行檢測，對蛋白的吸收峰進行積分得峰面積，并建立峰面積與濃度的線性回歸方程；

S6：根據S5中建立的蛋白濃度與峰面積的線性回歸方程，將口蹄疫病毒樣顆粒組裝混合液吸收峰的積分面積代入回歸方程，計算待測樣品中病毒樣顆粒的含量。

2.如權利要求1所述的采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，其特征在于：步驟S1中，在梯度混合儀使用前，應通過水平儀將梯度混合儀調至平衡。

3.如權利要求2所述的采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，其特征在于：步驟S3中，還通過去離子水為流動相，用于排出系統內的氣泡。

4.如權利要求1或3所述的采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，其特征在于：測定方法用于口蹄疫A型病毒樣顆粒組裝混合液和口蹄疫O型病毒樣顆粒組裝混合液的檢測。

5.如權利要求4所述的采用蔗糖密度梯度超速離心測定口蹄疫病毒樣顆粒的方法，其特征在于：測定方法還用于乳化的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的檢測。