[發明專利]一種骨髓上清液及其在細胞培養中的應用

有效

• 申請號: 202211068174.2
• 申請日: 2022-09-02
• 公開（公告）號: CN115125192B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 孟安明;張峻峰;馬騰蛟;胡加鑫;柯嵐;曹春偉;王海龍;張歡
• 申請（專利權）人: 廣州國家實驗室
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;C12N5/0789;A61K35/28;A61P17/02;A61P43/00
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎

本發明提供了一種骨髓上清液及其在細胞培養中的應用。該骨髓上清液通過對年幼哺乳動物或哺乳動物胎兒的骨髓樣品進行處理獲得，其作為培養基添加物用于細胞培養，可以實現有效和大量的擴增，具有廣泛的臨床應用前景。

技術領域

本發明涉及一種骨髓上清液及其在細胞培養中的應用。

背景技術

間質干細胞（Mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）是來源于中胚層的一類具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，可以從多個物種的多種組織中分離出MSCs，如骨髓、脂肪組織、外周血等。MSCs具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等，MSCs被廣泛應用于組織工程領域以及某些疾病的臨床試驗性治療當中。目前臨床應用主要使用胎牛血清作為培養添加物對MSCs進行體外擴增。但是，已有研究顯示胎牛血清（FBS）培養的MSCs后反復注射容易產生明顯的體液免疫反應，導致MSCs在體內被快速清除。此外，FBS培養體外擴增的MSCs在臨床實驗中部分受體容易發生免疫反應，例如出現蕁麻疹。因此，一些研究嘗試用其他物質代替FBS來培養MSCs，例如使用人血清、血漿代替FBS培養MSCs，但沒有獲得很好的效果，MSCs在培養至第四代時增殖速度明顯降低，出現分化偏好。因此，進一步尋找適合的間充質干細胞培養添加物很有必要，其不僅能夠促進MSCs的增殖、還要維持他們的組織修復功能以及有益于其在特定疾病中的應用。

新生哺乳動物骨髓作為造血器官，內部含有不同類型的細胞，如骨髓基質細胞（即骨髓間充質干細胞），內皮細胞，以及各種免疫細胞。這些細胞可產生多種細胞因子、細胞外基質、以及多種小分子等，構成為多種干細胞存活、干性維持和分化提供適合的微環境。因此，可以預期骨髓上清液有望作為干細胞培養添加物的優質來源。目前已公開的骨髓上清液作為細胞培養添加物的專利中，專利WO2021040735A基于對成年馬骨髓上清液的研究發明了一種在包含骨髓上清液（BMS）的細胞培養基中擴增間充質干細胞(MSCs)以產生無異種蛋白的間充質干細胞的方法。該方法從平均年齡11.5歲（2-17歲不等）的雌性馬收集骨髓上清液體，發現其可替代血清用于體外培養MSCs。考慮到馬、牛、山羊、綿羊、人成年個體、尤其是不同年齡段個體的骨髓液在活性成份組成上的存在巨大差異，可能導致其對干細胞的作用大不相同。另外，該專利中使用骨髓上清液作為干細胞培養添加物均主要用作同種或自體細胞培養，取材有限，難以大規模應用。專利CN103881971A發明了一種在基礎細胞培養基中添加了2-5%體積百分比的人體自體骨髓血漿培養和擴增間充質干細胞的方法，但是此方法取材困難，在臨床應用方面增加了患者自身的抽髓痛苦。另外，該專利中使用骨髓上清液作為干細胞培養添加物均主要用作同種或自體細胞培養，取材有限，難以大規模應用。

發明內容

基于現有技術中存在的問題，本發明提供了一種骨髓上清液的制備方法以及其在細胞培養中的應用。通過使用本發明的骨髓上清液作為細胞培養添加物，替代胎牛血清在體外有效擴增不同種類細胞（例如干細胞，原代細胞，以及永生化細胞等），特別地用于擴增干細胞時能夠維持相應的干細胞特性，效果優于現有方法所制備的成年個體骨髓上清液。本發明應用新生動物來源骨髓上清液培養細胞，解決自體取材中的困難，來源更易獲取，適合大規模生產應用。本發明所涉及的培養產物（例如間充質干細胞與造血干細胞及其細胞產物）已廣泛應用于組織修復、干細胞移植等各種臨床疾病的治療，因此本發明制備的新生哺乳動物骨髓上清液具有較好的應用前景和市場價值。

在第一方面，本發明提供了一種骨髓上清液，其通過對非人類新生哺乳動物的骨髓樣品進行處理獲得。

在一些實施方式中，所述處理包括使所述骨髓樣品的骨髓內容物在緩沖液中溶解、釋放的步驟。

在一些實施方式中，所述哺乳動物選自牛、羊、豬或馬。在一些實施方式中，所述哺乳動物選自牛，例如為黃牛、奶牛或安格斯牛等。

在一些實施方式中，所述哺乳動物選自出生1天至1個月的非人類新生哺乳動物。在一些實施方式中，所述哺乳動物選自出生1天至20天，更優選選自出生1天至10天，進一步優選選自出生1天至7天的非人類新生動物。