[發明專利]NDRV和MDRV的微滴數字PCR試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202211061626.4
• 申請日: 2022-09-01
• 公開（公告）號: CN116064942A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 尹彥文;劉惠心;施開創;龍鳳;謝守玉;熊陳勇;韋顯凱;馮淑萍;屈素潔;陸文俊;李劍鋒
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 張珣

本發明公開了NDRV和MDRV兩種病毒的微滴數字PCR試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括如序列表中SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6所述的引物對和探針，本發明方法針對NDRV的S3基因組和MDRV的S2的基因組區域綜合設計引物對和探針，并且優化用于微滴數字PCR檢測的樣品選取及處理方法、擴增反應液組成和配比、微滴生成和PCR擴增步驟的工作條件，得到一種快速、準確、靈敏的且能夠同時檢測NDRV和MDRV兩種病毒的微滴數字PCR檢測方法，為實驗室同時鑒別檢測這兩種病毒提供了有效的技術手段。

技術領域

本發明屬于動物病毒學和分子生物學技術領域，具體涉及一種NDRV和MDRV的微滴數字PCR試劑盒及其檢測方法。

背景技術

?經典番鴨呼腸孤病毒（Muscovy?duck?reovirus，MDRV）主要感染2～4周齡雛番鴨，死亡率為10%～50%，主要病理變化為肝脾腫大并出現白色壞死灶。新型鴨呼腸孤病毒（Novel?duck?reovirus，NDRV）除感染番鴨外，亦能導致麻鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨、鵝等水禽發病，該病以肝、脾嚴重出血性壞死為特征，死亡率為5%～50%。NDRV和MDRV都嚴重損害免疫器官，造成免疫抑制，且存在混合感染，已成為影響養殖業健康發展的重要疫病之一。

?現有病毒檢測方法包括將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈擴增（PCR）相結合的RT-PCR技術、逆轉錄環介導等溫擴增?(RT-LAMP)?和實時定量RT-PCR。然而，傳統的?RT-PCR檢測工作量大，因為它們需要對PCR產物進行凝膠分析，不適合高通量檢測。RT-LAMP檢測需要在一個反應中使用六條引物，由于引物之間的非特異性配對，容易產生假陽性結果。與傳統的PCR方法相比，實時定量RT-PCR污染概率更低，反應速度更快，靈敏度更高，但是由于實時定量RT-PCR的結果取決于循環閾值（Ct）與標準校準曲線之間的關系，所以也有一定的局限性。而微滴數字PCR（droplet?digital?PCR，ddPCR）是一種新的分子技術，可以在不使用標準樣品的情況下通過泊松分布校正得到目標基因的絕對拷貝數進而進行定量，對非常低的模板濃度有著極高的靈敏度和精確度。由于可以實現絕對定量和增強檢測靈敏度，數字PCR技術可用于檢測病毒感染、病毒潛伏期檢測、殘留病毒載量等。目前我國已有報道針對鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、豬圓環病毒（PCV）、豬偽狂犬病毒（PRV）等單種致病病毒的微滴數字PCR檢測方法，尚未有關于NDRV或MDRV微滴數字PCR檢測方法。

發明內容

本發明公開了一種針對NDRV和MDRV的微滴數字PCR試劑盒及其檢測方法，其具有特異性好、靈敏度高的優點，能夠同時檢測NDRV和MDRV兩種病毒，為實驗室鑒別檢測兩種病毒提供了有效的技術手段。

本發明是采用如下技術方案實現的：

NDRV和MDRV的微滴數字PCR試劑盒，其包括以下引物和探針，

用于檢測NDRV的引物為：

NDRV-F：5’-GGGTCGCACTACAGAGCAACT-3’（SEQ?ID?NO.1）；

NDRV-R：5’-CGCCTCATCATAGTAATCTGCAA-3’（SEQ?ID?NO.2）；

用于檢測NDRV的探針為：

NDRV-P：VIC-CTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATG-BHQ3（SEQ?ID?NO.3）；

用于檢測MDRV的引物為：

MDRV-F：5’-CCCAATGTTGTGGCGTTCTA-3’（SEQ?ID?NO.4）；

MDRV-R：5’-ATGGTGCGGGAAGCAAAC-3’（SEQ?ID?NO.5）；

用于檢測MDRV的探針為：

MDRV-P：FAM-ATTATGGCGCGCCTCCAACGG-BHQ1（SEQ?ID?NO.6）。