[發明專利]NDRV和MDRV的微滴數字PCR試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202211061626.4
• 申請日: 2022-09-01
• 公開（公告）號: CN116064942A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 尹彥文;劉惠心;施開創;龍鳳;謝守玉;熊陳勇;韋顯凱;馮淑萍;屈素潔;陸文俊;李劍鋒
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 張珣

1.NDRV和MDRV的微滴數字PCR試劑盒，其特征在于：包括以下引物和探針，

用于檢測NDRV的引物為：

NDRV-F：5’-GGGTCGCACTACAGAGCAACT-3’；

NDRV-R：5’-CGCCTCATCATAGTAATCTGCAA-3’；

用于檢測NDRV的探針為：

NDRV-P：VIC-CTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATG-BHQ3；

用于檢測MDRV的引物為：

MDRV-F：5’-CCCAATGTTGTGGCGTTCTA-3’；

MDRV-R：5’-ATGGTGCGGGAAGCAAAC-3’；

用于檢測MDRV的探針為：

MDRV-P：FAM-ATTATGGCGCGCCTCCAACGG-BHQ1。

2.NDRV和MDRV的檢測方法，其特征在于：所述檢測方法為NDRV和MDRV兩種病毒的微滴數字PCR檢測方法，其具體包括以下步驟：

（1）樣品處理：取待測樣品0.5?g，放入裝有無菌鋼珠的2?mL滅菌離心管中，加入1?mL生理鹽水，利用磨碎儀研磨至糜狀，離心后取上清液200?μL，通過核酸提取試劑盒自動抽提總RNA后，利用天根生物FastKing?cDNA第一鏈合成試劑盒將其反轉錄成cDNA備用；所述待測樣品為水禽的組織樣品；

（2）擴增反應液配制：將步驟（1）中反轉錄得到的cDNA作為模板進行ddPCR擴增反應，采用如SEQ?ID?NO.1～NO.6所示的引物和探針配制擴增反應液，所述擴增反應液總體積為25μL，其包括：PerfeCTa?qPCR?ToughMix?UNG?12.5μL，濃度為1μM的Fluorescein?sodium?salt2.5μL，模板2.5μL，余量為無RNA酶雙蒸水；所述擴增反應液中還有以下濃度的引物和探針：1000nM的NDRV-F，1000nM的NDRV-R，300nM的NDRV-P，1200nM的MDRV-F，1200nM的MDRV-R，400nM的MDRV-P；

（3）微滴生成和PCR擴增：將步驟（2）中配制得到的擴增反應液加入到Sapphire芯片的孔井中并封閉孔井，然后將其轉移到Naica?Geode微滴生成和擴增系統中進行微滴生成和PCR擴增，所述PCR擴增的反應程序為：

Step1：95℃預變性15s；

Step2：95℃變性5s，59℃退火34s，共進行45個循環；

（4）微滴信號的讀取和分析：將經過步驟（3）處理的Sapphire芯片移入Nacia?Prism?3儀器中，選擇好熒光通道和芯片位置后開始讀取芯片中的微滴數和熒光值，然后儀器會自動對每個芯片拍照，并對芯片中的每個微滴進行三色檢測器掃描，確定陰陽性微滴信號，并且根據泊松分布原理計算出絕對檢測濃度。

3.根據權利要求2所述的NDRV和MDRV的檢測方法，其特征在于：步驟（1）中所述待測樣品包括水禽的氣管、肺、肝、脾、腎、胸腺和法氏囊中的任意一種或多種組織樣品。