[發明專利]使用可編程DNA結合蛋白增強靶向基因組修飾

在審

• 申請號: 202211060110.8
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN116064529A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: F.陳
• 申請（專利權）人: 西格馬－奧爾德里奇有限責任公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N5/10;C12N15/90;A61K48/00;A61P7/06;A61P27/02;A61P37/04;A61P25/14
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 彭昶

使用可編程DNA結合蛋白來增加靶向基因組修飾的效率和/或特異性或促進真核細胞中特定基因組位點的檢測的組合物和方法。

技術領域

本公開內容涉及用于提高靶向基因組修飾的效率和/或特異性的組合物和方法。

背景技術

可編程核酸內切酶越來越成為真核生物中靶基因組工程或修飾的重要工具。最近，RNA引導的成簇規律間隔的短回文重復(CRISPR)/CRISPR-相關的(Cas)(CRISPR/Cas)系統已作為新一代基因組修飾工具出現。與前幾代核酸酶，例如鋅指核酸酶(ZFN)和轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)相比，這些新的可編程核酸內切酶大大提高了基因組編輯能力。

然而，并非所有基因組靶標都可通過這些可編程核酸內切酶進行有效修飾。事實上，一些CRISPR-Cas核酸內切酶似乎在人類細胞中幾乎沒有或沒有活性。染色質結構尤其可能成為這些可編程核酸內切酶的障礙并阻止它們與靶序列結合。因此，需要改進這些可編程核酸內切酶對靶序列的可及性和/或提高靶向基因組修飾的效率。此外，需要通過降低脫靶效應來增加靶向基因組修飾的特異性。

發明內容

在本公開內容的多個方面中包括一種組合物，其包含(a)可編程DNA修飾蛋白或編碼可編程DNA修飾蛋白的核酸和(b)至少一種可編程DNA結合蛋白或編碼至少一種可編程DNA結合蛋白的核酸。通常，可編程DNA修飾蛋白具有核酸酶活性(即切割雙鏈序列的兩條鏈)或非核酸酶活性(例如表觀遺傳修飾活性或轉錄調節活性)和所述至少一種可編程DNA結合蛋白缺乏核酸酶活性。

在可編程DNA修飾蛋白具有核酸酶活性的實施方案中，例如可編程DNA修飾蛋白可選自RNA引導的成簇規律間隔的短回文重復(CRISPR)/CRISPR相關(Cas)(CRISPR/Cas)核酸酶系統、CRISPR/Cas雙切口酶系統、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)、大范圍核酸酶(meganuclease)、包含與核酸酶結構域(即產生雙鏈DNA斷裂)連接的可編程DNA結合結構域的融合蛋白及其組合。

在可編程DNA修飾蛋白具有非核酸酶活性的實施方案中，例如可編程DNA修飾蛋白可以是融合蛋白，其包含與非核酸酶修飾結構域連接的可編程DNA結合結構域。在某些實施方案中，融合蛋白的可編程DNA結合結構域可以是無催化活性的CRISPR/Cas系統、無催化活性的大范圍核酸酶、鋅指蛋白或轉錄激活因子樣效應子，并且融合蛋白的非核酸酶修飾結構域可具有乙酰轉移酶活性、脫乙酰酶活性、甲基轉移酶活性、去甲基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素連接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、豆蔻酰化活性、去豆蔻酰化活性、瓜氨酸化活性、解旋酶活性、氨基化活性、脫氨基化活性、烷基化活性、脫烷基化活性、氧化活性、轉錄激活活性或轉錄阻遏活性。在具體的實施方案中，融合蛋白的非核酸酶修飾結構域具有胞嘧啶脫氨酶活性、組蛋白乙酰轉移酶活性、轉錄激活活性或轉錄阻遏活性。

根據本文公開的組合物的某些實施方案，所述至少一種可編程DNA結合蛋白可以是無催化活性的CRISPR/Cas系統、無催化活性的大范圍核酸酶、鋅指蛋白、轉錄激活因子樣效應子、CRISPR/Cas切口酶、ZFN切口酶、TALEN切口酶或大范圍核酸酶切口酶。

通常，編碼可編程DNA修飾蛋白和/或至少一種可編程DNA結合蛋白的核酸是mRNA或DNA。在一些實施方案中，編碼可編程DNA修飾蛋白和/或至少一種可編程DNA結合蛋白的核酸是載體的一部分，例如質粒載體、慢病毒載體、腺伴隨病毒載體、或腺病毒載體。