[發明專利]使用可編程DNA結合蛋白增強靶向基因組修飾

在審

• 申請號: 202211060110.8
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN116064529A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: F.陳
• 申請（專利權）人: 西格馬－奧爾德里奇有限責任公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N5/10;C12N15/90;A61K48/00;A61P7/06;A61P27/02;A61P37/04;A61P25/14
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 彭昶

1.一種組合物，包含：

(a)可編程DNA修飾蛋白或編碼可編程DNA修飾蛋白的核酸，其中所述可編程DNA修飾蛋白是RNA引導的成簇規律間隔的短回文重復(CRISPR)核酸酶系統；

(b)至少一種可編程DNA結合蛋白或編碼至少一種可編程DNA結合蛋白的核酸，其中所述至少一種可編程DNA結合蛋白是缺乏核酸酶活性的CRISPR系統；和

(c)包含供體序列的供體多核苷酸；

其中各個CRISPR系統包含CRISPR蛋白和引導RNA；

其中所述可編程DNA修飾蛋白靶向于靶染色體序列，并且至少一種可編程DNA結合蛋白中的每種都靶向于靶染色體序列任一側的約250個堿基對內的位點；和

其中每種CRISPR蛋白是II型CRISPR蛋白或V型CRISPR蛋白。

2.權利要求1的組合物，其中至少一種可編程DNA結合蛋白靶向于靶染色體序列任一側的約100個堿基對內的位點。

3.權利要求2的組合物，其中至少一種可編程DNA結合蛋白靶向于靶染色體序列任一側的約75個堿基對內的位點。

4.權利要求3的組合物，其中至少一種可編程DNA結合蛋白靶向于靶染色體序列任一側的約50個堿基對內的位點。

5.權利要求4的組合物，其中至少一種可編程DNA結合蛋白靶向于靶染色體序列任一側的約25個堿基對內的位點。

6.權利要求1-5中任一項的組合物，其中缺乏核酸酶活性的CRISPR系統是無催化活性的CRISPR蛋白。

7.權利要求1至6中任一項的組合物，其中編碼每種CRISPR蛋白的核酸是mRNA或DNA。

8.權利要求1至7中任一項的組合物，其中編碼每種CRISPR蛋白的核酸和/或編碼每種引導RNA的核酸是質粒載體或病毒載體的一部分。

9.權利要求1至8中任一項的組合物，其中每種CRISPR系統的引導RNA至少部分是化學合成的。

10.權利要求1至9中任一項的組合物，其中每種CRISPR系統的引導RNA是酶促合成的。

11.一種試劑盒，其包含權利要求1至10中任一項的組合物。

12.一種用于在真核細胞中靶向基因組修飾的體外或離體方法，所述方法包括向真核細胞中引入：

(a)可編程DNA修飾蛋白或編碼可編程DNA修飾蛋白的核酸，其中所述可編程DNA修飾蛋白是RNA引導的成簇規律間隔的短回文重復(CRISPR)核酸酶系統；

(b)至少一種可編程DNA結合蛋白或編碼至少一種可編程DNA結合蛋白的核酸，其中所述至少一種可編程DNA結合蛋白是缺乏核酸酶活性的CRISPR系統；和

(c)包含供體序列的供體多核苷酸；

其中各個CRISPR系統包含CRISPR蛋白和引導RNA；

其中所述可編程DNA修飾蛋白靶向于靶染色體序列，并且至少一種可編程DNA結合蛋白中的每種都靶向于靶染色體序列附近的位點；

其中所述至少一種可編程DNA結合蛋白與靶染色體序列附近位點的結合提高可編程DNA修飾蛋白對靶染色體序列的可及性，從而提高靶向基因組修飾效率和/或特異性；

其中每種CRISPR蛋白是II型CRISPR蛋白或V型CRISPR蛋白；和

其中所述靶染色體序列附近的位點位于所述靶染色體序列任一側的約250個堿基對內，

其中所述方法不包括用于修飾人類生殖細胞系遺傳身份的方法或者人胚胎的工業或商業目的的應用。

13.權利要求12的方法，其中所述靶染色體序列附近的位點位于所述靶染色體序列任一側的約100個堿基對內。