[發(fā)明專利]一種鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211057034.5
• 申請(qǐng)日: 2022-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN115181722A
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張力;楊東東;許加龍;朱善元
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

本發(fā)明公開了一種鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)方法，該鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是通過體外分離、培養(yǎng)和純化制備得到的；其中，鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離包括消化、分離、衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)和差速貼壁純化衛(wèi)星細(xì)胞。本發(fā)明首次利用Dispase II和膠原酶II共同作用分散消化鵝骨骼肌，經(jīng)過濾和紅細(xì)胞裂解處理分離得到鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。在體外培養(yǎng)過程中，利用含有20％FBS并添加bFGF的DMEM/F12生長完全培養(yǎng)基維持衛(wèi)星細(xì)胞的分化潛能，并且培養(yǎng)過程中涉及的培養(yǎng)皿經(jīng)基質(zhì)膠特別包被處理。通過上述方法得到具有高度分化能力的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)分化，能形成成熟肌管且分化指數(shù)高達(dá)78％以上。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)方法，該方法得到的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞具有高分化潛能。

背景技術(shù)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)家畜肉品質(zhì)的要求也日益提高。鵝肉是理想的高蛋白、低脂肪和低膽固醇的營養(yǎng)食品，早在2002年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織就將鵝肉列為21世紀(jì)重點(diǎn)發(fā)展的健康產(chǎn)品之一。在我國，鵝肉深受消費(fèi)者喜青睞。因而開展鵝產(chǎn)肉性能品種改良，發(fā)掘鵝肌肉生長的功能基因，探究鵝骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理，開展鵝肌肉遺傳育種的研究，具有重大的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。

具有高分化潛能的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的獲得是開展鵝肌肉組織生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究的前提和基礎(chǔ)。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞來源于肌刀中的一部分成肌祖細(xì)胞,位于肌膜和基底膜之間。這些細(xì)胞在出生后個(gè)體的肌肉組織中保留未分化狀態(tài)，具有很強(qiáng)的分化潛能。早在1961年，科學(xué)家就通過電子顯微鏡觀察青蛙骨骼肌肌纖維外圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)了肌源性衛(wèi)星細(xì)胞(Mauro,1961)。1974年,Bischoff等首次從成年大鼠骨骼肌中分離出衛(wèi)星細(xì)胞(Bischoff,1974)。之后,人們通過不斷優(yōu)化分離方法，逐漸分離出人類(Blau andWebster,1981),綿羊(Dodson et al.,1986),雞(Bennett et al.,1986),牛(Dodson etal.,1987)等不同物種的衛(wèi)星細(xì)胞。然而到目前為止，有關(guān)鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的方法研究很少，且已有方法分離得到的衛(wèi)星細(xì)胞分化能力有限(Wang et al.,2021)。因此本研究提供了一種新的體外分離鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明分離得到的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞具有高度分化的潛能，可以作為肌肉組織的體外誘導(dǎo)分化模型，為鵝肌肉組織的生長發(fā)育調(diào)控分子機(jī)制的研究提供了研究材料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高分化潛能的分離和培養(yǎng)鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及其分離和培養(yǎng)的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：

一種鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟：

(1)消化：將清洗后的鵝的肌肉組織剪成肉糜狀，加入消化工作液消化50min～60min；

(2)分離：加入含有3％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化；充分分散消化液后，再將其依次用100μm的細(xì)胞篩和40μm的細(xì)胞篩過濾，離心，棄上層溶液；用紅細(xì)胞裂解液重懸離心后得到的細(xì)胞，輕柔吹打多次，靜置2～5min，再加入DPBS緩沖液，離心，棄上層溶液，收集沉淀；

(3)衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)：用鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基重懸沉淀，輕柔吹打均勻后，轉(zhuǎn)移至經(jīng)基質(zhì)膠包被后的培養(yǎng)皿中，用鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代衛(wèi)星細(xì)胞；不換液，每兩天添加部分新的鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基；原代培養(yǎng)過程中，部分衛(wèi)星細(xì)胞貼壁緩慢，若換液會(huì)損失部分衛(wèi)星細(xì)胞；

(4)差速貼壁純化衛(wèi)星細(xì)胞：原代衛(wèi)星細(xì)胞在經(jīng)基質(zhì)膠包被后的培養(yǎng)皿中5～7天匯合度達(dá)到90％以上，進(jìn)行傳代；用胰酶消化后，收集細(xì)胞到離心管中，離心，收集沉淀，用鵝骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長完全培養(yǎng)基重懸沉淀，再轉(zhuǎn)移至未經(jīng)基質(zhì)膠包被處理的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中靜置45min～60min，吸取培養(yǎng)皿中上層培養(yǎng)基到新的經(jīng)基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)皿中，十字混勻，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。