[發明專利]一種鵝骨骼肌衛星細胞的體外分離和培養方法

在審

• 申請號: 202211057034.5
• 申請日: 2022-08-30
• 公開（公告）號: CN115181722A
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 張力;楊東東;許加龍;朱善元
• 申請（專利權）人: 江蘇農牧科技職業學院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

1.一種鵝骨骼肌衛星細胞的體外分離和培養方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)消化：將清洗后的鵝的肌肉組織剪成肉糜狀，加入消化工作液消化50min～60min；

(2)分離：加入含有3％胎牛血清的高糖DMEM培養基終止消化；充分分散消化液后，再將其依次用100μm的細胞篩和40μm的細胞篩過濾，離心，棄上層溶液；用紅細胞裂解液重懸離心后得到的細胞，輕柔吹打多次，靜置2～5min，再加入DPBS緩沖液，離心，棄上層溶液，收集沉淀；

(3)衛星細胞的培養：用鵝骨骼肌衛星細胞生長完全培養基重懸沉淀，輕柔吹打均勻后，轉移至經基質膠包被后的培養皿中，用鵝骨骼肌衛星細胞生長完全培養基在培養箱中培養原代衛星細胞；

(4)差速貼壁純化衛星細胞：原代衛星細胞在經基質膠包被后的培養皿中5～7天匯合度達到90％以上，進行傳代；用胰酶消化后，收集細胞到離心管中，離心，收集沉淀，用鵝骨骼肌衛星細胞生長完全培養基重懸沉淀，再轉移至未經基質膠包被處理的培養皿中，放入培養箱中靜置45min～60min，吸取培養皿中上層培養基到新的經基質膠包被的培養皿中，十字混勻，放入培養箱中繼續培養。

2.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(1)所述的消化工作液中，每10mL消化工作液包含6.9mL高糖DMEM、1.5mL膠原酶Ⅱ儲液、1.5mL的DispaseⅡ儲液和0.1mL青霉素鏈霉素混合液。

3.根據權利要求2所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于所述的Dispase II儲液的制備是用50mL DPBS溶解1g Dispase II，充分溶解后用0.2μm的濾器過濾，-20℃儲存；所述的膠原酶II儲液的制備是用125mL DPBS溶解5g膠原酶II，充分溶解后用0.2μm的濾器過濾，-20℃儲存。

4.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(1)所述的清洗后的鵝的肌肉組織是在DPBS浸泡清洗3次。

5.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(1)所述的每1cm³的肌肉組織用5～10mL消化工作液，消化的條件為37℃搖床上震蕩。

6.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(3)所述的鵝骨骼肌衛星細胞生長完全培養基為含有20％FBS并添加bFGF的DMEM/F12。

7.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(3)所述的經基質膠包被后的培養皿的包被步驟如下：將基質膠包被液加入到培養皿中，能夠覆蓋培養皿底部，放入培養箱中靜置3min以上，回收基質膠包被液。

8.根據權利要求7所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于所述的鵝骨骼肌衛星細胞培養中采用的基質膠包被液的配制如下：將基質膠和高糖DMEM按照1:24的體積比例混合，4℃保存。

9.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(2)和步驟(4)所述的離心條件為4℃，1500×g離心5～10min。

10.根據權利要求1所述的分離和培養鵝骨骼肌衛星細胞的方法，其特征在于步驟(2)所述的培養原代衛星細胞時，每兩天添加部分新的鵝骨骼肌衛星細胞生長完全培養基。