[發明專利]豬流行性腹瀉病毒細菌樣顆粒及其制備方法

在審

• 申請號: 202211048656.1
• 申請日: 2022-08-29
• 公開（公告）號: CN116003538A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 劉金鳳;吳健敏;沙奕羽;覃紹敏;林俊;陳鳳蓮;秦樹英;馬玲;韋玨;許力士;韋珊珊;陸晨陽;楊磊
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/165
• 分類號: C07K14/165;C12N15/866;C12N5/10;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 廣西中知華譽知識產權代理有限公司 45140
• 代理人: 吳震輝

本發明涉及分子標記技術領域，特別涉及豬流行性腹瀉病毒(PEDV)細菌樣顆粒及其制備方法，本申請以廣西PEDV流行株的S1基因和COE基因為靶基因，利用昆蟲細胞?桿狀病毒表達系統，成功表達了與錨鉤蛋白PA融合的融合蛋白S1?PA和COE?PA；同時，熱酸處理乳酸乳球菌MG1363去除菌體核酸和蛋白，成功制備GEM顆粒，并成功將融合蛋白S1?PA和COE?PA分別展示于其表面，得到S1?GEM和COE?GEM顆粒，兩種顆粒與GEL?01佐劑混合制備成兩種細菌樣顆粒疫苗，進行小鼠免疫，經免疫途徑、免疫原及免疫劑量篩選證實24μg?COE?GEM滴鼻免疫小鼠能達到最優的免疫效果。

【技術領域】

本發明涉及分子標記技術領域，特別涉及豬流行性腹瀉病毒細菌樣顆粒及其制備方法。

【背景技術】

豬流行性腹瀉(Porcine?epidemic?diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine?epidemic?diarrhea?virus,PEDV)引起以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的急性、高度接觸性豬腸道傳染病，各年齡段豬群均可感染，其中哺乳仔豬發病率和死亡率可高達100％。自1971年首次出現在英國后，PEDV已在世界范圍內廣泛傳播，造成了相當大的經濟損失。雖然歐洲國家僅有零星疫情發生，但在亞洲，PEDV一直是豬場腹瀉爆發的主要原因。

PEDV為套式病毒目、冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬成員，包含纖突(S)、囊膜(E)、膜(M)和核衣殼(N)4種結構蛋白，其中S蛋白是PEDV重要的結構蛋白和免疫原性抗原，攜帶主要的B淋巴細胞抗原表位，是研制PEDV疫苗和藥物的主要靶標。S基因的缺失、插入或氨基酸的突變是PEDV突變體的主要特征，也是PED全球流行的主要原因。S1是S蛋白的主要結構域，位于病毒表面，含有PEDV重要的3個中和表位區域，在機體抗原免疫反應中起重要作用。COE是2002年發現的S1基因中的一段重要核心表位，研究證實其同樣據有良好的反應原性，能夠誘導機體產生中和抗體，被認為是研制PED亞單位疫苗和抗病毒藥物研發的主要靶標抗原。

PEDV感染性極強，疫苗免疫是預防PEDV的重要措施之一，但近年來常有免疫豬場發生PED的報道，分析其主要原因除了目前PEDV流行株不斷發生變異，現有的疫苗免疫難以對PEDV變異株提供足夠的免疫保護外，也可能與現有疫苗不能誘導動物機體產生足夠的粘膜免疫有關。研究表明，腸粘膜上皮細胞分泌的sIgA能有效中和侵襲部位的病毒，通過粘膜途徑免疫的疫苗比其他接種方式的疫苗能更有效的誘導黏膜免疫的產生。目前，有兩種策略用于提高動物黏膜免疫反應。一是利用適合的載體通過粘膜進行疫苗免疫，二是添加粘膜免疫增強劑以常規免疫途徑進行免疫，粘膜免疫增強劑和粘膜給藥載體的研發應用對PED傳統疫苗和新型疫苗的研制具有重要意義。

PED是一種急性病毒性腸道感染疫病。傳統觀點認為PEDV主要通過糞口途徑傳播，但越來越多研究表明，空氣傳播也會導致PEDV暴發?，F有研究發現PEDV可以通過噴鼻感染仔豬引起典型的腹瀉癥狀，并能發展為短暫的鼻上皮感染，證實PEDV主要通過鼻粘膜感染機體。大量研究證實，與IgG抗體相比，粘膜免疫產生的sIgA抗體對通過粘膜感染的病毒具有更高的保護率。因此，針對PEDV病毒的特性，有必要開發新型疫苗，以通過粘膜免疫使粘膜部位誘導局部反應抵御病毒對呼吸道和胃腸道的感染，提高機體對病毒的抵抗力。同時，自2010年以來，致病性強的PEDV新變異株出現，在我國豬群中快速傳播，于全國各地大規模流行，但現有的PEDV疫苗卻不能對其提供有效的保護，因此開發針對變異流行株的PEDV新型疫苗具有重要意義。

本研究首次以PEDV廣西主要流行毒株抗原基因為靶基因，將GEM-PA表面展示系統應用于PEDV疫苗研究，制備的PEDV細菌樣顆粒疫苗免疫小鼠，通過體液、細胞和粘膜免疫三方面評估其免疫原性，探究PEDV細菌樣顆粒疫苗的可行性，為研制PEDV新型疫苗打下基礎。

【發明內容】