[發明專利]豬流行性腹瀉病毒細菌樣顆粒及其制備方法

在審

• 申請號: 202211048656.1
• 申請日: 2022-08-29
• 公開（公告）號: CN116003538A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 劉金鳳;吳健敏;沙奕羽;覃紹敏;林俊;陳鳳蓮;秦樹英;馬玲;韋玨;許力士;韋珊珊;陸晨陽;楊磊
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/165
• 分類號: C07K14/165;C12N15/866;C12N5/10;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 廣西中知華譽知識產權代理有限公司 45140
• 代理人: 吳震輝

1.豬流行性腹瀉病毒細菌樣顆粒，其特征在于，所述顆粒包括在GEM顆粒表面展示重組蛋白S1-PA或COE-PA；所述S1-PA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述COE-PA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

2.如權利要求1所述豬流行性腹瀉病毒細菌樣顆粒在制備防治由PEDV感染引起的豬流行性腹瀉疫苗上的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述疫苗免疫途徑為肌肉注射、灌胃和/或滴鼻。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述滴鼻免疫途徑免疫原為表面展示COE-PA蛋白的GEM顆粒，命名為COE-GEM；所述滴鼻途徑免疫原的COE-GEM濃度為24μg。

5.如權利要求1所述豬流行性腹瀉病毒細菌樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)構建融合基因及其重組表達質粒：將PEDV的S1基因或COE基因進行昆蟲細胞密碼子優化，在其5’端引入Kozak序列和GP67信號肽序列，然后通過連接肽linker將其分別與密碼子優化的乳酸乳球菌PA基因進行融合構建融合基因S1-PA或COE-PA，定向克隆于pFastBacI載體，獲得重組表達質粒pFastBacI-S1-PA或pFastBacI-COE-PA；所述融合基因S1-PA的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1；所述融合基因COE-PA的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2；

(2)將步驟(1)獲得的重組質粒pFastBacI-S1-PA或pFastBacI-COE-PA轉化DH10Bac感受態細胞制備重組桿粒Bacmid-S1-PA或Bacmid-COE-PA；

(3)將重組桿粒Bacmid-S1-PA或Bacmid-COE-PA分別轉染Sf9細胞進行P1代重組毒的拯救，獲得P1代重組桿狀病毒，分別命名為Rbv-S1-PA、Rbv-COE-PA；將Rbv-S1-PA或Rbv-COE-PA按MOI＝1的接毒比例接種Sf9細胞進行重組蛋白的表達，重組蛋白經鑒定后，收集細胞裂解上清液；

(4)制備GEM顆粒：將乳酸乳球菌MG1363經熱酸處理后去除乳酸乳球菌核酸及自身蛋白質獲得GEM顆粒；

(5)取0.1U步驟(4)的GEM顆粒加入步驟(3)的細胞裂解上清液中，取負載最大結合量融合蛋白獲得S1-GEM或COE-GEM顆粒，將兩種顆粒分別與GEL-01佐劑混合制備成得到S1-GEM顆粒疫苗或COE-GEM顆粒疫苗；所述S1-GEM顆粒疫苗在GEM顆粒表面展示重組蛋白S1-PA；所述COE-GEM顆粒疫苗在GEM顆粒表面展示重組蛋白COE-PA。