[發(fā)明專利]一管式RT-qPCR全預混反應試劑、應用及RT-qPCR方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211045852.3
• 申請日: 2022-08-30
• 公開（公告）號: CN116004776A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設計）人: 顧東東;趙百慧;馬彬恒;侯巧利
• 申請（專利權）人: 上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C07K16/40;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 張金銘

本發(fā)明涉及反轉錄熒光PCR技術領域，尤其是涉及一管式RT?qPCR全預混反應試劑、應用及RT?qPCR方法。本發(fā)明的一種一管式快速RT?qPCR全預混反應體系。本發(fā)明主要針對現(xiàn)有RT?qPCR反應體系存在的三個問題：(1)總反應體系分成多管保存，每次使用時各組分需要現(xiàn)配現(xiàn)用，引物探針必需單獨保存或與擴增反應液一起保存，將各組分提前預混后會導致反應體系穩(wěn)定性和特異性問題；(2)RT?qPCR反應體系無法適應快速擴增程序，反應時間過長，不適用于快速檢測；(3)RT?qPCR反應體系與引物探針的適配性不足，需要根據(jù)不同的引物探針組合調(diào)整反應體系的配方。

技術領域

本發(fā)明涉及反轉錄熒光PCR技術領域，尤其是涉及一管式RT-qPCR全預混反應試劑、應用及RT-qPCR方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(polymerase?chain?reation?PCR)是利用單鏈募核苷酸引物對特異DNA片段進行體外快速擴增的一種方法，該反應是一個指數(shù)式反應，可在短時間內(nèi)使極微量的目的DNA片段特異地擴增上百萬倍。

RT-qPCR則是在PCR的基礎上加入了反轉錄酶，以RNA為原始模板進行擴增得到DNA的方法。RT-qPCR根據(jù)反應體系中加入的熒光基團所積累的熒光信號強度變化，對PCR反應中的每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)控。

目前常用的RT-qPCR反應體系由核酸擴增緩沖液、酶混合液、引物探針反應液等組成且需要單獨保存，在使用時需要將各組分室溫溶解充分混勻后待用，使用時將各組分按照固定比例加入混勻后再分裝到pcr管中，整個流程需要進行計算和仔細操作，會經(jīng)常出現(xiàn)配錯的情況，而且反應體系需要現(xiàn)配現(xiàn)用，如提前將核酸擴增緩沖液、酶混合液、引物探針反應液預混，冷凍或冷藏保存后會出現(xiàn)穩(wěn)定性問題，具體表現(xiàn)為靈敏度下降和陰性樣本中出現(xiàn)非特異性擴增。

RT-qPCR反應體系中引物探針在快速程序下的擴增效率與反應體系中的核酸擴增緩沖液和酶混合液有直接關系，一般情況下一組引物探針需要對應開發(fā)一組核酸擴增緩沖液和酶混合液，反應體系之間不能混用，RT-qPCR反應體系對各種引物探針反應液的適用性較差。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種一管式RT-qPCR全預混反應試劑，使用該試劑制備一管式RT-qPCR全預混反應體系后，用于RT-qPCR反應，以期解決現(xiàn)有RT-qPCR反應體系各組分單獨保存、需要現(xiàn)配現(xiàn)用，全預混后靈敏度下降、非特異性增加、保存穩(wěn)定性下降，引物探針適用性低的問題。

為了解決上述技術問題，實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供一管式RT-qPCR全預混反應試劑，所述試劑包括帶有雙封閉能力Taq酶單克隆抗體。

在可選的實施方式中，所述帶有雙封閉能力Taq酶單克隆抗體的氨基酸序列如SEQID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。

在可選的實施方式中，所述帶有雙封閉能力Taq酶單克隆抗體與Taq?DNA聚合酶的含量比(U/U)為1:3～9，優(yōu)選為1:5。

在可選的實施方式中，還包括核酸適配體。

在可選的實施方式中，所述核酸適配體含有的堿基數(shù)量為50～100bp。

優(yōu)選地，所述核酸適配體的濃度為0.2～0.7ng/mL，優(yōu)選為0.5ng/mL。

在可選的實施方式中，還包括穩(wěn)定劑和/或增強劑。

優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑包括0.5～1mg/mL?BSA、0.005％～0.008％(v/v)明膠、5％～10％(v/v)甘油或0.1％～0.2％(v/v)非離子型去垢劑中至少兩種。

優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑包括0.7mg/mL?BSA、0.006％(v/v)明膠和7％(v/v)甘油。