[發(fā)明專利]東莨菪內(nèi)酯的酶法制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211038918.6
• 申請(qǐng)日: 2022-08-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115927500A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁偉;郭富友;肖慶禮;楊亮;王建林;袁明;彭奎;周紅;萬(wàn)鳳琳;簡(jiǎn)渝凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué);重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12P17/06
• 分類號(hào): C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11489
• 代理人: 曲晶晶

本發(fā)明涉及一種東莨菪內(nèi)酯的酶法制備方法，具體包括先制備含有F6’H1基因和阿魏酰輔酶A合成酶基因的重組基因工程菌；再將重組基因工程菌活化、發(fā)酵后，以阿魏酸為底物再發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)化得東莨菪內(nèi)酯。經(jīng)基因序列優(yōu)化后，本發(fā)明首次將阿魏酰輔酶A合成酶和F6’H1酶同時(shí)構(gòu)建在大腸桿菌中且實(shí)現(xiàn)二者同時(shí)高效的功能性共表達(dá)。建立了以價(jià)格低廉、安全低毒可持續(xù)的阿魏酸為底物，通過(guò)“兩個(gè)酶?兩步催化?一鍋合成”的方式快速高效便捷合成具有高附加值的產(chǎn)物東莨菪內(nèi)酯。本發(fā)明以1mM阿魏酸為底物催化12h后，生產(chǎn)摩爾產(chǎn)率達(dá)到86.5％，獲得以阿魏酸為底物生產(chǎn)東莨菪內(nèi)酯最高產(chǎn)量166.28mg/L，催化過(guò)程簡(jiǎn)單、環(huán)保，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及東莨菪內(nèi)酯的酶法制備方法。

背景技術(shù)

東莨菪內(nèi)酯，又稱東莨菪素、莨菪酚、莨菪亭，化學(xué)名為7-羥基-6甲氧基香豆素，英文名為：scopoletin，屬于香豆素類化合物中的一種，分子式為C₁₀H₈O₄，相對(duì)分子質(zhì)量為192.17，是植物體內(nèi)一種重要的酚類抗毒素。東莨菪內(nèi)酯廣泛存在于多種藥用植物、雜草和作物中，目前發(fā)現(xiàn)含有東莨菪內(nèi)酯的植物超過(guò)110000種。東莨菪內(nèi)酯已證實(shí)具有多種生物活性，臨床上具有抗癌、抗炎、保肝、解痙攣的作用，同時(shí)也有研究表明東莨菪內(nèi)酯可以通過(guò)降血壓、調(diào)節(jié)血脂抑制主動(dòng)脈收縮從而抗心血管疾病，對(duì)老年癡呆癥也具有很好的治療作用，還具有抗血小板凝聚、抗HIV和抗氧化等活性。

隨著東莨菪內(nèi)酯的活性不斷被挖掘，市場(chǎng)的需求日益增大，東莨菪內(nèi)酯的生產(chǎn)問(wèn)題成為了研究的熱點(diǎn)。然而，目前東莨菪內(nèi)酯的獲取主要通過(guò)從中藥植物黃花蒿的組織中進(jìn)行分離提取。然而東莨菪內(nèi)酯在植物中的含量非常低下，傳統(tǒng)的獲取方式在提倡環(huán)境友好型社會(huì)發(fā)展的當(dāng)下有著諸多的弊端。其次，植物中的多種東莨菪內(nèi)酯類似物難以通過(guò)低成本和無(wú)公害的方式進(jìn)行去除。化學(xué)合成現(xiàn)今面臨反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，高耗能、毒副產(chǎn)品及環(huán)境污染等難題未能解決。合成生物學(xué)的發(fā)展為諸多植物次生代謝產(chǎn)物的合成提供了可能。它主要是利用重組微生物工程菌株的發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)，微生物菌株能簡(jiǎn)便地從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)，且具有生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)成本低、產(chǎn)物提純簡(jiǎn)便和環(huán)境污染少等優(yōu)勢(shì)，相比起來(lái)，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，利用基因工程技術(shù)改造大腸桿菌，使其生物合成東莨菪內(nèi)酯的研究報(bào)道很少。Lin等^[1]在大腸桿菌中共表達(dá)酪氨酸解氨酶(Tyrosine?ammonia-lyase，TAL)、大腸桿菌羥化酶(two-component?flavin-dependent?monoxygenase，HpaBC)、咖啡酰-CoA-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase，CcoOMT)、4-香豆酰-CoA連接酶(4CL)和阿魏酰-CoA-6’-羥化酶(Feruloyl-CoA?hydroxylase，F(xiàn)6’H)，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖和甘油為碳源生成31mg/L東莨菪內(nèi)酯。Yang等^[2]將F6’H與GST標(biāo)簽蛋白融合后，增強(qiáng)了F6’H的穩(wěn)定性和溶解性，以阿魏酸為底物生成了80mg/L東莨菪內(nèi)酯。由此可以看出，微生物制備東莨菪內(nèi)酯仍處于起步階段，有許多問(wèn)題有待解決，能完善和優(yōu)化出一套東莨菪內(nèi)酯合成制備體系，定將對(duì)東莨菪內(nèi)酯的產(chǎn)業(yè)有重要的推動(dòng)作用。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成效率高的東莨菪內(nèi)酯的酶法制備方法。該方法可高產(chǎn)東莨菪內(nèi)酯，催化過(guò)程簡(jiǎn)單、環(huán)保，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、東莨菪內(nèi)酯的酶法制備方法，包括以下步驟：

A.制備含有F6’H1基因和阿魏酰輔酶A合成酶基因的重組基因工程菌；

B.將重組基因工程菌活化、發(fā)酵后，以阿魏酸為底物再發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)化得東莨菪內(nèi)酯。