[發明專利]東莨菪內酯的酶法制備方法

在審

• 申請號: 202211038918.6
• 申請日: 2022-08-29
• 公開（公告）號: CN115927500A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 丁偉;郭富友;肖慶禮;楊亮;王建林;袁明;彭奎;周紅;萬鳳琳;簡渝凡
• 申請（專利權）人: 西南大學;重慶中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 曲晶晶

1.東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.制備含有F6’H1基因和阿魏酰輔酶A合成酶基因的重組基因工程菌；

B.將重組基因工程菌活化、發酵后，以阿魏酸為底物再發酵培養轉化得東莨菪內酯。

2.根據權利要求1所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，所述F6’H1基因的序列如SEQ?ID?NO.1所示,所述阿魏酰輔酶A合成酶基因的序列如SEQ?ID?NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，步驟A中制備重組基因工程菌的表達菌株為大腸桿菌菌株BL21(DE3)。

4.根據權利要求1-3任一項所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，步驟A重組基因工程菌的具體制備方法為：

1)將人工合成F6’H1基因構建至質粒pUC57，得到含有目的基因的質粒pUC57-F6’H1；設計包含Bam?HI酶切位點的上游引物F6‘H1-BamHI-F和包含Eco?RI酶切位點的下游引物F6‘H1-EcoRI-R，以pUC57-F6‘H1為模板，PCR擴增含有雙酶切位點的F6‘H1基因：ggatcc+F6‘H1+gaattc；同樣分別經BamHI和EcoRI雙酶切載體pGEX-6p-1；將上述目的片段和載體用T4連接酶進行連接；連接完畢后，轉化到宿主細胞感受態中；挑選含有F6’H1基因的陽性克隆；

2)將人工合成阿魏酰輔酶A合成酶基因構建至質粒pUC57，得到含有目的基因的質粒pUC57-FCS；設計包含EcoRI酶切位點和核糖體結合位點rbs的上游引物FCS-EcoRI-rbs-F和包含XhoI酶切位點的下游引物FCS-XhoI-R，以pUC57-FCS為模板，PCR擴增含有雙酶切位點和核糖體結合位點的FCS基因片段：ggatcc+aaggagatatacca+FCS+ctcgag；同樣分別經BamHI和EcoRI雙酶切載體pGEX-F6‘H1；將上述目的片段和載體用T4連接酶進行連接；連接完畢后，轉化到宿主細胞感受態中；最后得到含有F6’H1基因和阿魏酰輔酶A合成酶基因的重組基因工程菌。

5.根據權利要求4所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，所述上游引物F6‘H1-BamHI-F的序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述下游引物F6‘H1-EcoRI-R的序列如SEQ?IDNO.6所示。

6.根據權利要求1所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，所述上游引物FCS-EcoRI-rbs-F的序列如SEQ?ID?NO.9所示；所述下游引物FCS-XhoI-R的序列如SEQ?ID?NO.10所示。

7.根據權利要求1所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，步驟B中發酵具體為：將活化后的重組基因工程菌以1:20-70的比例接種于LB培養基中，37℃，250rpm恒溫培養直至OD600達到0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.8-1.2mM，37℃，250rpm恒溫繼續培養4-12h。

8.根據權利要求1所述的東莨菪內酯的酶法制備方法，其特征在于，轉化后還包括取發酵液加入同等體積的乙酸乙酯進行萃取得到東莨菪內酯。

9.一種用于制備東莨菪內酯的F6‘H1基因，其特征在于，所述F6’H1基因的序列如SEQID?NO.1所示。

10.一種用于制備東莨菪內酯的阿魏酰輔酶A合成酶基因，其特征在于，所述阿魏酰輔酶A合成酶基因的序列如SEQ?ID?NO.3所示。