[發(fā)明專利]基于納米孔測(cè)序儀的靶向擴(kuò)增引物、擴(kuò)增建庫(kù)方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211004947.0
• 申請(qǐng)日: 2022-08-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115198002A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛凌峰;楊狄;唐旖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州柏熠科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/689;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 杭州匯和信專利代理有限公司 33475
• 代理人: 吳琰

本發(fā)明提供一種基于納米孔測(cè)序儀的靶向擴(kuò)增引物、擴(kuò)增建庫(kù)方法及應(yīng)用，設(shè)計(jì)特殊的靶向擴(kuò)增引物，該靶向擴(kuò)增引物由依次排序的定位序列、分子標(biāo)簽序列和擴(kuò)增引物組成，將基于納米孔測(cè)序平臺(tái)靶向擴(kuò)增高通量測(cè)序整個(gè)過(guò)程僅分為靶向擴(kuò)增+混樣末端修復(fù)+加接頭測(cè)序三個(gè)步驟，在提高接頭連接效率的同時(shí)直接引入高通量測(cè)序分子標(biāo)簽，避免待測(cè)序列的分子標(biāo)簽污染，且簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)復(fù)雜程度，可被應(yīng)用所有基于Nanopore測(cè)序儀的靶向擴(kuò)增測(cè)序，包括但不限于對(duì)細(xì)菌和古菌、病毒的納米孔測(cè)序。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序領(lǐng)域，特別涉及一種基于納米孔測(cè)序儀的靶向擴(kuò)增 引物、擴(kuò)增建庫(kù)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

納米孔測(cè)序技術(shù)依賴于一個(gè)納米級(jí)的蛋白質(zhì)孔，納米孔作為一個(gè)生物傳感 器被嵌入在一個(gè)由一組連接到傳感器芯片上的微支架支撐的耐電聚合物膜中， 易位過(guò)程中離子電流的變化與傳感區(qū)域中存在的核苷酸序列相對(duì)應(yīng)，從而能夠 對(duì)其進(jìn)行解碼，允許對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)序。納米孔測(cè)序技術(shù)正在被大量應(yīng) 用于基因組組裝、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序和核苷酸突變檢測(cè)，以及快速臨床診斷和疫 情監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。

現(xiàn)有納米孔測(cè)序接頭連接方式分為快速法測(cè)序接頭連接和連接法測(cè)序接頭 連接，快速法接頭連接基于轉(zhuǎn)座酶將待測(cè)DNA分子或RNA分子與納米孔測(cè)序?qū)?用接頭連接上，然后加載到測(cè)序芯片中進(jìn)行納米孔測(cè)序。連接法接頭連接基于 T4連接酶將待測(cè)DNA分子或DNA-RNA雜交分子與納米孔測(cè)序?qū)Ｓ媒宇^連接上 (或?qū)⒋郎y(cè)DNA分子或DNA-RNA雜交分子先與分子標(biāo)簽連接，再與納米孔測(cè)序 專用接頭連接上實(shí)現(xiàn)多樣本測(cè)序)，形成待測(cè)雙鏈核酸分子----分子標(biāo)簽---- 測(cè)序接頭復(fù)合體，最后加載到測(cè)序芯片中進(jìn)行納米孔測(cè)序。然而快速法的接頭 連接方式接頭效率低下，在處理高通量樣本測(cè)序時(shí)很難獲得足夠深度的測(cè)序數(shù) 據(jù)；連接法測(cè)序接頭連接方式進(jìn)行T/A接頭連接，接頭連接效率更高，且在處 理多樣本高通量建庫(kù)時(shí)需要引入分子標(biāo)簽，導(dǎo)致建庫(kù)時(shí)需要更多的試劑成本和 時(shí)間成本。

目前引入分子標(biāo)簽的方式有以下幾種：

1.如圖1所示，在對(duì)低濃度核酸樣本靶向擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，第一輪進(jìn)行靶向擴(kuò) 增并純化去除引物干擾，第二輪擴(kuò)增時(shí)將分子標(biāo)簽與第一輪擴(kuò)增含有引 物序列退火相結(jié)合形成引物池二次擴(kuò)增，接著將樣本pooling并末端修 復(fù)，最后與連接法測(cè)序接頭進(jìn)行連接測(cè)序。

2.在對(duì)高濃度核酸樣本靶向擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，如圖2所示，將待測(cè)序核酸進(jìn)行 末端修復(fù)純化，然后與分子標(biāo)簽接頭通過(guò)T/A連接，再以分子標(biāo)簽為引 物進(jìn)行擴(kuò)增并純化，接著將樣本pooling并末端修復(fù)，最后與連接法測(cè) 序接頭進(jìn)行連接測(cè)序。

3.在對(duì)高濃度核酸樣本靶向擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，如圖2所示，將待測(cè)序核酸進(jìn)行 末端修復(fù)純化，然后與分子標(biāo)簽的接頭通過(guò)T/A連接，接著將樣本 pooling并與多樣本測(cè)序接頭進(jìn)行連接測(cè)序。

然而以上提到的接頭連接方式均存在效率低下、分子標(biāo)簽引入容易造成污 染、建庫(kù)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，無(wú)法很好地滿足快速高通量的測(cè)序需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米孔測(cè)序儀的長(zhǎng)片段靶向擴(kuò)增引物、擴(kuò) 增建庫(kù)方法及應(yīng)用，靶向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，擴(kuò)增和建庫(kù)過(guò)程簡(jiǎn)單易懂，且為 納米孔測(cè)序儀提供了一整套簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的分子標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)方法和后續(xù)調(diào)整的建 庫(kù)方案，設(shè)計(jì)的分子標(biāo)簽?zāi)苤苯颖粶y(cè)序儀識(shí)別，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，第一方面，本技術(shù)方案提供了一種基于納米孔測(cè)序儀的 靶向擴(kuò)增引物，由依次排序的定位序列、分子標(biāo)簽序列和擴(kuò)增引物序列組成。

在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增引物為16s基因通用引物，覆蓋16srDNA基因全長(zhǎng)。

16s序列是所有細(xì)菌共有的基因，本方案針對(duì)細(xì)菌序列的16s基因在保守區(qū) 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，進(jìn)而使得該靶向擴(kuò)增引物可適用于各類的細(xì)菌。

在一些實(shí)施例中，分子標(biāo)簽序列選自96種通用的分子標(biāo)簽序列的一種或者 多種。