[發明專利]糖蛋白二硫鍵的鑒定方法

在審

• 申請號: 202210997010.1
• 申請日: 2022-08-19
• 公開（公告）號: CN115356414A
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 鄧巧春;鄧欽培;楊嘉明;謝佳倩;容宜欣;關欣;路勇
• 申請（專利權）人: 珠海市麗珠單抗生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N33/68
• 代理公司: 北京華進京聯知識產權代理有限公司 11606
• 代理人: 董娟

本發明涉及一種糖蛋白中二硫鍵的鑒定方法。本發明方法包括TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法，所述TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法包括以下步驟：(S1)取待測糖蛋白樣品，進行變性處理；(S2)用三(2?羰基乙基)磷鹽酸鹽溶液還原后，加入N?乙基馬來酰亞胺反應，脫鹽；(S3)加入去糖基化酶，脫鹽后測定蛋白濃度；(S4)加入嗜熱菌蛋白酶；(S5)進行UPLC?MS分析。本發明方法提供了一種準確、簡單、高效地鑒定蛋白質二硫鍵位點的方法。

技術領域

本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種糖蛋白二硫鍵的鑒定方法。

背景技術

人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)，是一種糖蛋白，由α和β兩個亞基組成。兩個亞基上各含一簇半胱氨酸結(Cystine-knots，主要模式為Cys-X-Gly-X-Cys)。這也增加了二硫鍵鑒定的復雜性。

二硫鍵的解析方法，包括差異烷基化法和多波長反常散射法(MAD)。MAD法是通過切除糖修飾后進行適當的還原以及修飾，獲得晶體后測定蛋白質的構象，但是其對樣品需求量大，并且程序繁多。差異烷基化法，其選擇還原劑對蛋白首先進行部分還原，再對打開的半胱氨酸進行封閉，再加強還原條件，用可以與前者相區別的標記試劑對后續打開的二硫鍵進行修飾。例如Mise等人的研究中：首先采用DTT對蛋白進行部分還原，用14C標記的碘乙酸對uhCG進行烷基化。之后，再完全還原，用未加標記的碘乙酸對打開的二硫鍵進行烷基化。通過edman降解，獲得肽段信息，統計每個半胱氨酸位點的同位素標記含量，以標記含量一致的半胱氨酸作為一對二硫鍵(Journal of Biological Chemistry,1980,255(18):8516-8522；Journal of Biological Chemistry,1981,256(13):6587-6592)。作者用這種方法，鑒定結果與后期的hCG晶體結構研究數據(Nature,1994,369(6480),455-461)多有不同，如Mise等人報道的α-亞基中含有C10-C32、C28-C60二硫鍵，而晶體結構研究表明這兩對二硫鍵的連接方式應為：C10-C60、C32-C28。

由此可見二硫鍵鑒定的復雜性，特別是復雜糖蛋白中二硫鍵的鑒定十分困難。因此，一種準確、簡單、高效地鑒定糖蛋白二硫鍵位點的方法仍然是目前亟待解決的技術難題。

發明內容

基于此，本發明的目的是提供一種能解決上述難題，能準確、高效地鑒定糖蛋白中二硫鍵位點的方法。

具體技術方案如下：

一種糖蛋白中二硫鍵的鑒定方法，其包括TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法，所述TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法包括以下步驟：

(S1)取待測糖蛋白樣品，進行變性處理；

(S2)用三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(即：TCEP)溶液還原后，加入N-乙基馬來酰亞胺(即：NEM)溶液反應，脫鹽；

(S3)加入去糖基化酶，脫鹽后測定蛋白濃度；

(S4)加入嗜熱菌蛋白酶(即：Thermolysin)；

(S5)進行UPLC-MS分析。

在其中一些實施方式中，所述糖蛋白為人絨促性腺素(即：hCG)。

在其中一些實施方式中，步驟(S1)所述變性處理所用試劑包括鹽酸胍溶液，所述鹽酸胍溶液的pH為(3±0.5)，所述鹽酸胍溶液的濃度為1-10mol/L。

在其中一些實施方式中，步驟(S1)中，所述待測糖蛋白先濃縮后再進行變性處理；所述濃縮為使用超濾離心管進行濃縮。