[發明專利]糖蛋白二硫鍵的鑒定方法

在審

• 申請號: 202210997010.1
• 申請日: 2022-08-19
• 公開（公告）號: CN115356414A
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 鄧巧春;鄧欽培;楊嘉明;謝佳倩;容宜欣;關欣;路勇
• 申請（專利權）人: 珠海市麗珠單抗生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N33/68
• 代理公司: 北京華進京聯知識產權代理有限公司 11606
• 代理人: 董娟

1.一種糖蛋白中二硫鍵的鑒定方法，其特征在于，其包括TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法，所述TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法包括以下步驟：

(S1)取待測糖蛋白樣品，進行變性處理；

(S2)用三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽溶液還原后，加入N-乙基馬來酰亞胺溶液反應，脫鹽；

(S3)加入去糖基化酶，脫鹽后測定蛋白濃度；

(S4)加入嗜熱菌蛋白酶；

(S5)進行UPLC-MS分析。

2.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述糖蛋白為人絨促性腺素；和/或，步驟(S1)所述變性處理所用試劑包括鹽酸胍溶液，所述鹽酸胍溶液的濃度為1-10mol/L，所述鹽酸胍溶液的pH為(3±0.5)。

3.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(S2)中，所述三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽溶液的濃度為30-50mM，所述三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽溶液還原的反應條件包括：30-60℃反應10-30min。

4.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(S3)中，所述去糖基化酶為Deglycosylation MixⅡ；和/或，步驟(S4)中，所述嗜熱菌蛋白酶進行酶切的條件包括：60-70℃環境下酶切15-20小時。

5.根據權利要求1-4任一項所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(S5)中，UPLC的流動相為：有機相為0.05-0.2wt％甲酸的水溶液；有機相為0.05-0.2wt％甲酸的乙腈溶液；UPLC的洗脫梯度條件為：

0-60min：有機相的體積百分比由1-5％上升到35～40％；

60-63min：有機相的體積百分比由35～40％上升到98～100％；

63-65min：有機相的體積百分比為98～100％；

65-68min：有機相的體積百分比由98～100％降低至1-5％；

68-72min：有機相的體積百分比為1-5％。

6.一種糖蛋白中二硫鍵的鑒定方法，其特征在于，其包括采用TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法與差異烷基化法；其中，所述TCEP部分還原后嗜熱菌蛋白酶切法如權利要求1-5任一項所述；所述差異烷基化法包括以下步驟：

(1)樣品制備：取待測糖蛋白樣品進行變性處理；

(2)用三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽溶液進行還原后，再與N-乙基馬來酰亞胺溶液反應；

(3)脫鹽、變性，再酶切除蛋白上的糖修飾，醇沉產物；

(4)鹽酸胍溶解沉淀，用二硫代蘇糖醇溶液還原后與碘乙酰胺溶液反應，再進行UPLC-MS分析。

7.根據權利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中，所述變性處理所用試劑包括鹽酸胍溶液，所述鹽酸胍溶液的pH為(3±0.5)；進一步地，所述鹽酸胍溶液的濃度為1-10mol/L。

8.根據權利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(2)所述三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽溶液的濃度為0.01-1mol/L；所述待測糖蛋白樣品與三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽的用量比為0.2mg：(0.001-0.005)mmol；和/或，步驟(2)所述N-乙基馬來酰亞胺溶液的濃度為0.2-0.3mol/L，所述待測糖蛋白樣品與所述N-乙基馬來酰亞胺的用量比為0.2mg：(0.001-0.01)mmol。

9.根據權利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(4)所述二硫代蘇糖醇還原的條件包括：30-60℃還原30-60min；所述二硫代蘇糖醇溶液的濃度為0.5-3mol/L，所述待測糖蛋白樣品與所述二硫代蘇糖醇的用量比為：0.2mg：(0.002-0.006)mmol；

和/或，步驟(4)所述碘乙酰胺溶液的濃度為1mol/L，所述糖蛋白樣品與碘乙酰胺的用量比為：0.2mg：(0.005-0.02)mmol。

10.根據權利要求6-9任一項所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(4)所述UPLC-MS分析中，UPLC的流動相為：有機相為0.05-0.2％甲酸的水溶液；有機相為0.05-0.2％甲酸的乙腈溶液；UPLC的洗脫梯度為：

0min：有機相的體積百分比為2-4％；

0-26min：有機相的體積百分比由2-4％提高到8-12％；

26-30min：有機相的體積百分比由8-12％提高到18-22％；

30-60min：有機相的體積百分比由18-22％提高到28-31％；

60-70min：有機相的體積百分比由28-31％提高到31.5-34％；

70-72min：有機相的體積百分比由31.5-34％提高到98-100％；

72-75min：有機相的體積百分比為98-100％；

75-77min：有機相的體積百分比由98-100％降低到1-5％；

77-80min：有機相的體積百分比為1-5％。