[發明專利]PRMT5基因敲除DF-1細胞株的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202210994467.7
• 申請日: 2022-08-18
• 公開（公告）號: CN116064525A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 吳歡生;鄔向東;游洪南;胡西鳳
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 南昌金軒知識產權代理有限公司 36129
• 代理人: 阮錦華

本發明公開了一種基于CRISPR?Cas9技術構建PRMT5基因敲除DF?1細胞株的構建方法及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明設計提供了一種特異性靶向PRMT5基因的sgRNA，該sgRNA能夠特異性靶向PRMT5基因并結合CRISPR?Cas9技術實現了宿主細胞完全敲除PRMT5基因。本發明還提供了一種通過CRISPR?Cas9技術結合上述sgRNA轉染進入DF?1細胞，通過篩選、稀釋、鑒定等步驟構建PRMT5基因敲除DF?1細胞株的具體方法。本發明所構建的敲除PRMT5基因DF?1細胞株誘導干擾素產生能力顯著提升，可用于DF?1細胞干擾素調節信號通路研究；本發明還發現DF?1細胞敲除PRMT5基因后能夠顯著抑制傳染性法氏囊病病毒的復制，為進一步研究PRMT5基因在細胞內調控IBDV復制的分子機制提供強有力的工具。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種基于CRISPR-Cas9技術構建PRMT5基因敲除DF-1細胞株的構建方法及其應用。

背景技術

自人類基因組實施以后，有關人和其他物種基因組信息得到全面破解，之后進入基因組功能研究時代，基因編輯技術由此發展起來?；蚓庉嫾夹g就是通過人為設計改造實現對特定基因及其特定位點進行精確編輯改造的基因工程技術。目前，基因編輯技術已經廣泛應用于生物醫學、模式動物、農業生物改造等領域。早期開發的基因編輯技術包含鋅指核酸內切酶(ZFNs)和轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALENs)；將外源DNA利用注射或瞬時電轉染的方法導入細胞或生殖細胞，外源導入的DNA引起細胞基因組損傷并發生同源重組，將導入的DNA片段插入到細胞基因組中。然而，由于上述技術對細胞活性的損傷較大，插入效率較低，因此其應用較為受限。CRISPR-Cas9基因編輯技術為衍生的第三代新型基因編輯技術，由Cas9核酸酶和特異性的導向RNA(sgRNA)組合構成，該技術應用范圍廣泛，操作便捷，具有廣闊的應用前景。

CRISPR-Cas9最早源于細菌/古細菌的一種獲得性免疫防疫機制，經人工改造開發得到，是利用單鏈導向RNA(sgRNA)介導的一種特異性靶向基因組編輯技術。人為設計一種靶向特定基因組的sgRNA，轉染進入細胞，sgRNA自由擴散進入細胞核，帶有入核序列的Cas9核酸酶進入細胞核，Cas9定向結合sgRNA靶向的基因組PAM序列并進行高效切割，切割后的基因組發生斷裂，并激發細胞固有的同源重組修復機制和非同源末端自我修復過程，實現對基因組特定位點的精確編輯和修飾。相比于第一代、第二代基因編輯技術，CRISPR-Cas9基因編輯技術能大規模實現基因精準編輯，使用便捷、編輯效率高、操作簡便、成本低廉、適用范圍廣泛，為基因組定向改造、調控與應用帶來巨大應用前景，因此該技術獲得2021年諾貝爾化學獎，目前已深度應用在精準醫療，胚胎基因編輯等領域。

宿主精氨酸甲基轉移酶5(Protein?Arginine?Methyl?transferase?5,PRMT5)是蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族中的一個成員，該家族所有成員均可催化底物蛋白發生單甲基精氨酸修飾，并增加第二個甲基，產生一個不對稱的二甲基精氨酸修飾。PRMT5屬于II型PRMT，可催化底物蛋白發生對稱二甲基精氨酸修飾，目前認為，多數精氨酸甲基化修飾位點符合RGG，RG和RXR重復序列。目前已報道PRMT5發揮甲基酶活性調節眾多底物，如AKT1、SERBP1、p53等，進而調節細胞信號通路的轉導。雞源存在5個PRMT成員，PRMT1,PRMT3,PRMT4,PRMT5和PRMT7，不存在PRMT2,PRMT6,PRMT8和PRMT9；至今未構建出雞源PRMT5基因敲除的DF-1細胞株。有關雞源PRMT5蛋白的生物學功能，對干擾素調節及病毒復制的作用仍然未知。

傳染性法氏囊病病毒(IBDV)為禽雙RNA病毒科唯一成員，主要攻擊3-5周齡的雛雞，損害雛雞的免疫中樞器官法氏囊，破壞雛雞的免疫機能，導致雛雞免疫功能低下，引起繼發感染，大大提高雛雞死亡率，俗稱“雞的艾滋病”。開展IBDV的基礎研究對防控IBDV至關重要，因此，通過CRISPR-Cas9基因編輯技術構建抑制IBDV復制的細胞株對研究IBDV特征意義重大。

發明內容