[發明專利]一種基于MLPA技術對菟絲子、油菜籽、萊菔子進行鑒定的方法

在審

• 申請號: 202210982905.8
• 申請日: 2022-08-16
• 公開（公告）號: CN115948507A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 汪波;胡敏;李小芳;徐玲;莫靜;王文斌;程華春
• 申請（專利權）人: 湖北省藥品監督檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種基于多重連接探針擴增技術對菟絲子、油菜籽、萊菔子進行鑒定的方法，它包括以下步驟：1)提取樣品基因組DNA；2)以基因組DNA為模板，設計特異性引物擴增ITS2序列；3)將擴增產物變性后與MLPA探針進行雜交；4)將雜交產物進行連接；5)利用通用引物對連接產物進行實時熒光定量PCR擴增；6)收集熔解曲線信號，觀測Tm值。本發明能夠在較短的時間內鑒別菟絲子、油菜籽、萊菔子，可有效檢測出摻混樣品，該方法具有特異性強，靈敏度高等優點，在中藥材真偽鑒定領域有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于中藥材鑒定領域，具體涉及一種用于鑒定菟絲子、萊菔子、油菜籽的多重連接探針擴增方法(multiplex?ligation-dependent?probe?amplification,MLPA)。

背景技術

中藥菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta?australis?R.Br.或菟絲子Cuscuta?chinensis?Lam的干燥成熟種子，主產于山東、內蒙古、河北、安徽等地，具有補益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉等功效，在《神農本草經》中被列為上品。菟絲子為寄生植物，因生長環境和自身繁殖方式的限制，致使其資源短缺，價格逐年攀升，市場上流通的菟絲子藥材中常出現摻偽、造假的現象，使其中藥材質量下降。常見偽品有十字花科蘿卜屬植物蘿卜Raphanus?sativus?L.的種子(習稱萊菔子)和十字花科蕓苔屬植物蕓苔Brassicacampestris?L.的種子(習稱油菜籽)，由于種子形態相近，利用傳統鑒別方法難以將三者區分，因此，為了臨床用藥安全、有效、精準，建立一種高效快速鑒別菟絲子及其混偽品的方法尤為重要。

多重連接探針擴增(multiplex?ligation-dependent?probe?amplification,MLPA)技術是一種近幾年發展起來的可以在單一反應管內同時對多個不同靶基因進行定性和半定量分析的核酸檢測技術。其原理是利用MLPA探針與靶序列雜交，然后通過連接酶進行探針的特異性連接，再用一對通用引物進行PCR擴增，最后利用毛細管電泳進行分離分析。該技術具有高通量、高特異性、檢測速度快且操作簡便等特點，目前，在病原微生物的檢測、腫瘤和遺傳性疾病的診斷以及中藥材真偽鑒定等領域已有廣泛應用。然而傳統的MLPA產物分析方法存在一些局限，進行毛細管電泳不僅費錢費時，而且將PCR產物取出過程中可能會出現交叉污染的風險。本發明在傳統MLPA技術上引入熔解曲線分析，并針對菟絲子、萊菔子、油菜籽核基因片段序列的變異位點設計了特異性MLPA探針，從而由熔解曲線分析獲取擴增產物的熔解溫度，根據熔解溫度的差異來鑒別菟絲子、萊菔子、油菜籽。本發明縮短了樣品檢測周期，降低了實驗成本，且為閉管操作避免了污染。本發明實現了菟絲子、萊菔子、油菜籽的藥材鑒定以及相互摻雜的快速檢測，為臨床用藥安全和市場監管提供了有力技術支持。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速鑒別菟絲子、萊菔子、油菜籽的方法，該方法針對藥材的核基因序列設計特異性探針，采用MLPA技術并結合熔解曲線，不僅提高了三種藥材的檢測效率，同時還具有很高的檢測靈敏度和特異性。

為實現上述目的，本發明使用了以下技術手段：

一方面，本發明提供了用于鑒定菟絲子、萊菔子、油菜籽的MLPA探針，所述探針共三組，分別由左探針(Left?Probe?Oligonucleotide,LPO)和右探針(Right?ProbeOligonucleotide,RPO)組成，探針序列如下：

菟絲子探針：

LPO：5′-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGTCGCCGTGGTTGGCCGAAAGTATTGTCCGTGATTTT-3′(SEQ?ID?NO:1)

RPO：5′-GTTGATGTCTTGGCGTGCGGTGGATGGGGCGGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC-3′(SEQ?ID?NO:2)

萊菔子探針：