[發(fā)明專利]一種基于MLPA技術對菟絲子、油菜籽、萊菔子進行鑒定的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210982905.8
• 申請日: 2022-08-16
• 公開（公告）號: CN115948507A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 汪波;胡敏;李小芳;徐玲;莫靜;王文斌;程華春
• 申請（專利權）人: 湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

1.一種基于多重連接探針擴增技術對菟絲子、油菜籽、萊菔子進行鑒定的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)提取樣品基因組DNA；

2)以步驟1)的基因組DNA為模板，設計特異性引物擴增菟絲子、油菜籽、萊菔子的ITS2序列；

3)將擴增產(chǎn)物變性后與MLPA探針進行雜交；

4)利用DNA連接酶將步驟3)的雜交產(chǎn)物進行連接；

5)利用通用引物對步驟4)的連接產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR擴增；

6)收集熔解曲線信號，觀測Tm值，

其中，所述MLPA探針共3組，每一組分別由左探針和右探針組成，各探針的序列如下：

第一組左探針：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGTCGCCGTGGTTGGCCGAAAGTATTGTCCGTGATTTT；右探針：GTTGATGTCTTGGCGTGCGGTGGATGGGGCGGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC；

第二組左探針：GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGGCGTCTTGACATGCGGTGGTGAATTCAATC；右探針：TCCTCGTCATATCGTCGCTCGTTCCGGTCCCCTCTAGATT?GGATCTTGCTGGCAC；

第三組左探針：GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGAGCGTCTTGACATGCGGTGGTGAATTTAATT；右探針：CTCGTCATATAGTCAGTCGTTCCGGTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC。

2.如權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述菟絲子的ITS2序列如SEQ?ID?NO:9所示；所述油菜籽的ITS2序列如SEQ?ID?NO:10所示、所述萊菔子的ITS2序列如SEQ?ID?NO:11所示。

3.如權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，用于擴增所述菟絲子、油菜籽、萊菔子ITS2序列的特異性引物如下；

上游引物:CTCTCGCATCGATGAAGAACG；

下游引物:TTGATATGCTTAAACTCAGCGGG。

4.如權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述通用引物如下：

上游引物:GGGTTCCCTAAGGGTTGGA；

下游引物:TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC。

5.如權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：所述DNA連接酶為9°N?DNA?Ligase。

6.如權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟3)中所述雜交的溫度是70℃，時間20min。

7.如權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟5)中所述實時熒光定量PCR擴增的反應循環(huán)數(shù)是28循環(huán)。

8.如權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟6)中，通過觀測樣品熔解曲線峰和Tm值判斷結果，若樣品出現(xiàn)單一熔解曲線峰并且Tm值為85.29℃±0.06℃，則為菟絲子；若樣品出現(xiàn)單一熔解曲線峰且Tm值為83.91℃±0.06℃，則為萊菔子；若樣品出現(xiàn)單一熔解曲線峰且Tm值為81.34℃±0.06℃，則為油菜籽；若樣品出現(xiàn)兩個或三個相應Tm值的熔解曲線峰，則為兩種或三種混合樣品。