[發明專利]一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點的引物組合及其LAMP檢測方法

在審

• 申請號: 202210981298.3
• 申請日: 2022-08-16
• 公開（公告）號: CN116004865A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 王保寧;陳昱作;符立法;唐智慧
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/46;C12R1/90
• 代理公司: 四川北新律師事務所 51366
• 代理人: 安延偉

本發明提供了一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點的引物組合及其LAMP檢測方法，涉及分子診斷的快速檢測技術領域。針對牛鏈球菌和牛球蟲雙病原的核酸基因的雙靶點同時檢測的引物組合，包括牛鏈球菌RecN基因引物組合和牛球蟲18srRNA基因引物組合；所述牛鏈球菌RecN基因引物組合為組合I，如序列表SeqIDNO.1～6所示；所述牛球蟲18srRNA基因引物組合為引物組合II，如序列表SeqIDNO.31～36所示；所述牛鏈球菌RecN基因引物組合和牛球蟲18srRNA基因引物組合具有靈敏度強、特異性高的特點，實現了牛鏈球菌和牛球蟲兩個牛病原體的同時檢測；所述檢測反應在60℃?64℃下，30?60min即可完成；檢測結果可視化，通過顏色變化即可判斷樣品是否存在牛鏈球菌或牛球蟲，能廣泛應用于牧區、農場等場所。

技術領域

本發明涉及分子診斷的快速檢測技術領域，具體涉及一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點的引物組合及其LAMP檢測方法。

背景技術

牛鏈球菌(Streptococcus?bovis)是牦牛瘤胃中常見的一種兼性厭氧菌，為非β-溶血性鏈球菌，存在于食草動物消化道內，會導致牦牛等反芻動物瘤胃酸中毒、腹瀉等胃腸道疾病。牛球蟲病是由多種類型的艾爾美球蟲(Eimeria)寄生在牛體內引發的一種具有傳染性的體內寄生蟲病，是全世界牛中最常見的寄生蟲病之一，艾美爾球蟲主要寄生在牛的直腸和小腸部位，當牛接觸到感染艾美耳球蟲的食物之后，球蟲直接進入到牛腸道卵囊中，然后分裂增殖，具有很強的感染性。在球蟲侵染初期，由于寄生蟲的數量相對較少，通常不會引發牛群出現典型的臨床癥狀，但隨著寄生蟲在牛腸道中的進一步繁殖增長并產生大量毒素，會造成牛群的腸道異常蠕動，不能很好地消化飼料中的營養物質，糞便常會隨著腸道異常蠕動排出體外，表現出嚴重的腹瀉癥狀。上述兩種病原均是近年來引起牦牛牧區流行且危害較大的牛疫病病原體，但基于診斷方法較為繁瑣、基礎執行不規范，準確度不高，嚴重威脅到牦牛的健康狀態，為農牧業帶來較大的經濟損失，阻礙牦牛業的發展。

目前，牛鏈球菌的檢測主要依靠細菌分離培養和16s?rRNA測序技術，但細菌的分離培養復雜耗時、需要在專業實驗室內由專業技術人員操作，因此測序技術需要專業的測序公司才能完成，無法實現在畜牧場對感染牛鏈球菌的牲畜進行快速現場檢測。此外，傳統的針對牛球蟲的檢測方法主要包括牛糞便樣本中的卵囊進行形態學檢查、飽和食鹽水漂浮法和麥克馬斯特法。然而，這些傳統的牛病原寄生蟲檢測方法不具備特異性，且檢測耗時，需要熟練的技術，存在一定的缺陷。由于牛鏈球菌和牛球蟲是牦牛常見的病原體，均導致牦牛腹瀉，無法從癥狀上區分牦牛的具體病因，因此需要開發一種快速、便捷、更具成本效益的方法準確識別牛鏈球菌和牛球蟲兩個牛病原體。

環介導等溫擴增(LAMP)技術依賴于靶DNA的6個獨立的區域，因此特異性非常高，反應在等溫條件下進行，則不需要PCR儀等昂貴設備，僅用水浴鍋等能夠維持穩定恒溫的設備即可完成，檢測成本大大降低，應用范圍顯著擴大，其高靈敏度、高特異性、快速的擴增得到了市場的檢驗和認可。

發明內容

針對上述問題，提供一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點的引物組合及其LAMP檢測方法，其中引物組合Ⅰ是根據牛鏈球菌RecN基因設計，引物組合Ⅱ是根據牛球蟲18s?rRNA基因設計，引物組合具有很高的靈敏度、特異性；反應在等溫條件下進行，不需要PCR儀等昂貴設備，僅用水浴鍋等能夠維持穩定恒溫的設備即可完成，檢測成本大大降低，應用范圍顯著擴大，可以在田間、牧區等進行實時監測。

本發明采用下述的技術方案：

一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點的引物組合，包括牛鏈球菌RecN基因引物組合和牛球蟲18s?rRNA基因引物組合。

所述牛鏈球菌RecN基因引物組合為引物組合I，包括兩個外引物RecN?1-F3和RecN1-B3、兩個內引物RecN?1-FIP和RecN?1-BIP、兩個環導引物RecN?1-LoopF和RecN?1-LoopB，序列表Seq?ID?NO.1～6所示。