[發(fā)明專利]一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的引物組合及其LAMP檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202210981298.3 | 申請日： | 2022-08-16 |
| 公開（公告）號： | CN116004865A | 公開（公告）日： | 2023-04-25 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王保寧;陳昱作;符立法;唐智慧 | 申請（專利權(quán)）人： | 四川大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/46;C12R1/90 |
| 代理公司： | 四川北新律師事務(wù)所 51366 | 代理人： | 安延偉 |
| 地址： | 610000 四*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 種牛 鏈球菌 牛球蟲雙靶點(diǎn) 引物 組合 及其 lamp 檢測 方法 | ||
1.一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的引物組合，其特征在于，包括牛鏈球菌RecN基因引物組合和牛球蟲18s?rRNA基因引物組合；所述牛鏈球菌RecN基因引物組合為引物組合I，包括以下6個(gè)引物：
RecN?1-F3：GGTCGTTCTATTAGCCGTATC；
RecN?1-B3：TCTCGATAGTGTTTTTTGACAG；
RecN?1-FIP：ACCGTGAATATCAACCAAGTACTGCGGTCAAATGGTTAATCTGAC；
RecN?1-BIP：TGACCAAGAAGAATTAATGAAGCCCCTGAAAAATGTTCATCCCCAA；
RecN?1-LoopF：CAACCGCACGAAGGGTT；
RecN?1-LoopB：AACATGCACATCCGTATGCT；
所述牛球蟲18s?rRNA基因引物組合為引物組合II，包括以下6個(gè)引物：
18s?rRNA3-F3：ACGCAAGGAAGTTTGAGGC；
18s?rRNA3-B3：GGGCGGTGTGTACAAAGG；
18s?rRNA3-FIP：ACCTTCCGGCCAAGGTCAAGA-CCCTTAGATGTTCTGGGCTG；
18s?rRNA3-BIP：TGAGTGTGCATCGTGATGGGGA-AGCTGCTGACTTACGCCTA；
18s?rRNA3-LoopF：TGCATGCATCAGTGTAGCG；
18s?rRNA3-LoopB：TTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的引物組合，其特征在于，所述引物組合I和引物組合II的靈敏度分別為1.0×102copies/μL和1.0×101copies/μL。
3.一種非診斷目的牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)提取樣本總DNA；
(2)利用引物組合I和引物組合II進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；
(3)結(jié)果判斷，若引物組合I以所述總DNA為模板擴(kuò)增成功，則為牛鏈球菌陽性結(jié)果；若引物組合Ⅱ以所述總DNA為模板擴(kuò)增成功，則為牛球蟲陽性結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種非診斷目的牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的LAMP檢測方法，其特征在于，所述引物組合I中，引物RecN?1-F3、RecN?1-B3、RecN?1-FIP、RecN?1-BIP、RecN1-LoopF、RecN?1-LoopB的濃度分別為1.2μmol/L、1.2μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L；所述引物組合II中，引物18s?rRNA3-F3、18s?rRNA3-B3、18s?rRNA3-FIP、18s?rRNA3-BIP、18s?rRNA3-LoopF、18s?rRNA3-LoopB的濃度分別為1.2μmol/L、1.2μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種非診斷目的牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的LAMP檢測方法，其特征在于，所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的條件為60℃-67℃，10-60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種非診斷目的牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的LAMP檢測方法，所述結(jié)果判斷是通過反應(yīng)體系中苯酚紅試劑的顏色變化得到；反應(yīng)結(jié)束后，若反應(yīng)體系是橙黃色，則為陽性結(jié)果，若反應(yīng)體系是紫紅色，則為陰性結(jié)果。
7.一種牛鏈球菌和牛球蟲雙靶點(diǎn)的LAMP檢測方法在同時(shí)檢測牛鏈球菌和牛球蟲中的應(yīng)用如下：
(1)制備用于檢測導(dǎo)致牦牛腹瀉的牛鏈球菌和牛球蟲的試劑盒；
(2)鑒定導(dǎo)致牦牛腹瀉的牛鏈球菌和牛球蟲；
(3)檢測待測樣本中是否含有導(dǎo)致牦牛腹瀉的牛鏈球菌和牛球蟲。
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