[發(fā)明專(zhuān)利]高產(chǎn)豐原素的枯草芽孢桿菌菌株及構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210978312.4
• 申請(qǐng)日: 2022-08-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115820705A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程景勝;高庚榮;丁明珠;元英進(jìn)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/75
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/75;C12N15/31;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/113;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/125
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專(zhuān)利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

本發(fā)明公開(kāi)了高產(chǎn)豐原素的枯草芽孢桿菌菌株及構(gòu)建方法,步驟：利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除菌株CGF01的srfAB?srfAC和pksBCDE基因片段，用P_veg啟動(dòng)子替換啟動(dòng)子P_fenC，得到重組菌株CGF04；對(duì)CGF04菌株利用P43啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶基因accBC和3?氧酰基?ACP合酶III基因fabHB，得到重組菌株CGF16；對(duì)CGF16菌株敲除生物膜形成相關(guān)基因片段tapA?sipW?tasA，敲除基因片段epsAB和敲除孢子形成相關(guān)基因spoIIIE，得到重組菌株CGF26；本發(fā)明所構(gòu)建的菌株豐原素產(chǎn)量高，菌株穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)，構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，易操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于枯草芽孢桿菌基因工程領(lǐng)域，具體涉及高產(chǎn)豐原素的枯草芽孢桿菌菌株及構(gòu)建方法及用途。

背景技術(shù)

豐原素是芽孢桿菌通過(guò)非核糖體肽合成途徑合成的一種環(huán)狀脂肽，由10個(gè)α-氨基酸和一個(gè)側(cè)鏈長(zhǎng)度為14-21個(gè)碳原子的β-羥基脂肪酸組成。合成豐原素的非核糖體肽合成酶系包含fenA，fenB，fenC，fenD，fenE(或ppsA-ppsE)五個(gè)操縱子。豐原素對(duì)絲狀真菌有特異性抑制作用，具有抗真菌、抗腫瘤、抗病毒等作用，在生物醫(yī)藥方面以及生物防治方面有較廣泛的應(yīng)用。

然而，豐原素的低產(chǎn)量限制了其應(yīng)用，目前主要通過(guò)替換啟動(dòng)子、優(yōu)化培養(yǎng)基組分及條件等方式提高其產(chǎn)量。Yaseen等將Bacillus subtilis BBG111的P_pps啟動(dòng)子替換為B.subtilis BBG21的P_fen啟動(dòng)子，得到菌株B.subtilis BBG203，其豐原素產(chǎn)量從1.4±0.5mg/L提高至11.5±1.46mg/L，提高了大約8倍(Yaseen Y,Gancel F,Drider D,BéchetM,Jacques P.Influence of promoters on the production of fengycin in Bacillusspp[J].Research in Microbiology,2016,167(4):272-281.)。Lu等探討果糖、阿拉伯糖和山梨醇對(duì)解淀粉芽孢桿菌fmb-60生產(chǎn)豐原素的影響，結(jié)果顯示果糖最有效地提高了細(xì)胞中合成豐原素所需的必需氨基酸成分的濃度，豐原素最大產(chǎn)量為392.87mg/L(Lu H,Qian S,Muhammad U,Jiang X,Han J,Lu Z.Effect of fructose on promoting fengycinbiosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens fmb-60[J].Journal of AppliedMicrobiology,2016,121(6):1653-1664.)。

脂肪酸是豐原素合成中的重要前體物質(zhì)。譚維等(CN113278644A)強(qiáng)化丙二酰輔酶A合成途徑的相關(guān)基因(acs、birA和accACD)，豐原素產(chǎn)量提升為24.73mg/L。靳佳琦等(CN113969258A)阻斷脂肪酸β氧化分解代謝基因fadB、強(qiáng)化脂肪酸酰基輔酶A基因yhfL表達(dá)、構(gòu)建生物素羧化酶yngH、硫酯酶tesA過(guò)表達(dá)菌株表達(dá)菌株，最終豐原素產(chǎn)量達(dá)到212.36mg/L。然而，脂肪酸途徑中涉及的其它基因(accBC和fabHB)目前在豐原素合成中沒(méi)被探究。