[發明專利]一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202210974952.8
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115725526B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 張玉基;黃善青;周康;王鵬
• 申請（專利權）人: 南京立頂醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/26;C12Q1/54;C12R1/19
• 代理公司: 南京佰騰智信知識產權代理事務所(普通合伙) 32509
• 代理人: 黃杭飛

本發明涉及體外診斷技術領域，尤其是一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt及其制備方法和應用，其蛋白序列如SEQ ID No：1所示，編碼該果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt的基因核酸序列如SEQ ID No：2所示。本發明的果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt，其催化能力較野生型提高了2倍左右，使其用量降低約50％，大大降低了人體血糖檢測成本，將有利于改進果糖賴氨酸氧化酶的人體血糖水平的檢測水平，提高試劑的反應靈敏度，提升試劑的在機穩定性，延長了試劑使用的壽命，提高了檢測終端的試劑利用率，大大降低了使用成本，實現了產品高效環保生產。

技術領域

本發明涉及體外診斷技術領域，具體領域為一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt及其制備方法和應用。

背景技術

果糖胺是人體中的葡萄糖與血漿中的蛋白發生非酶糖化過程中形成的高分子酮胺結構類似物，它的濃度和人體血糖濃度呈正相關性，因此其含量可反應人體血糖總體水平。人體血漿蛋白的半衰期是17-20天，因此，果糖胺可以反應人體2-3周平均血糖水平，是快速反應人體短期血糖水平的精準指標，尤其適用于對血糖波動較大的脆性糖尿病及妊娠糖尿病患者。

果糖胺的主要成分是糖化白蛋白，還包括糖化球蛋白、脂蛋白、氨基酸等。果糖胺的測定結果受到多種蛋白、膽紅素、乳糜、低分子物質的影響，不夠穩定。但是糖化白蛋白(Glycated Albumin，GA)只測量血液中糖化白蛋白一種物質的量，不受其他成分的影響，它的結構十分穩定，且不受高脂血壓、血紅蛋白病和年齡的影響，因此作為指示物用于檢測人體血糖含量。GA測定方法操作簡單，結果也比較準確，取樣時不受飲食的限制，是作為糖尿病人的診斷、治療和預防的一個理想監測指標，尤其是對糖尿病患者短期內血清葡萄糖控制情況及藥物療效方面有重要意義，可以及時診斷暴發性的糖尿病，因此在糖尿病預防和診斷中具有重要的應用價值。

目前，臨床上對于人體果糖胺濃度測定有如下方法：苯肼法、果糖法、親和色譜法、硝基四氮唑藍(NBT)法、糖醛法及果糖賴氨酸氧化酶法。其中，果糖賴氨酸氧化酶法檢測血糖水平具有特異性高、精密度好、抗干擾能力強、線性范圍寬等優點，能夠較好滿足臨床需求，是很有前途的人體血糖水平的檢測方法。

在開發測定人體糖化白蛋白試劑盒的過程中，發明人研究團隊發現因檢測試劑的特殊性，需果糖賴氨酸氧化酶具有更高的穩定性、催化活性及血液耐受性，以便于試劑的長期保存運輸和血液檢測的靈敏和高效性。但目前果糖賴氨酸氧化酶的性質仍有不足，且多為歐美等國進口產品，價格昂貴，檢測靈敏度、快捷性不能滿足臨床需求。

因此，篩選可在長期保存、血液復雜成分等條件下發揮催化活性的果糖賴氨酸氧化酶，是改進已有酶法檢測人體血糖水平用于糖尿病診斷治療的關鍵，對提高試劑檢測的靈敏度、穩定性以及節約生產成本、實現產品高效環保生產具有重要的意義。

發明內容

針對現有技術中果糖賴氨酸氧化酶相關研究較少，且存在穩定性差、血液催化活力低等缺點，本發明提供了一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt及其制備方法和應用。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明以尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的果糖賴氨酸氧化酶野生型FODw為出發蛋白，通過半理性設計構建突變文庫，對酶性質進行改良，以酶活為評價標準篩選獲得突變體酶命名為FODt，其催化活力相比野生型酶提高2.0倍。該突變體提高了果糖賴氨酸氧化酶的應用能力，降低了人體血糖酶法檢測的成本，有利于改進酶法檢測工藝，為解決現有酶法檢測血清糖化白蛋白中的問題提供l研究基礎。

一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt，其蛋白序列如SEQ ID No：1所示。

一種編碼上述果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt的基因，其核酸序列如SEQ ID No：2所示。

含有上述基因的重組表達菌株的構建方法，包括以下步驟：

(1)突變體FODt編碼基因的獲得