[發明專利]一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202210974952.8
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115725526B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 張玉基;黃善青;周康;王鵬
• 申請（專利權）人: 南京立頂醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/26;C12Q1/54;C12R1/19
• 代理公司: 南京佰騰智信知識產權代理事務所(普通合伙) 32509
• 代理人: 黃杭飛

1.一種果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID No：1所示。

2.一種編碼權利要求1所述果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt的基因，其特征在于：其核酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.一種含權利要求2所述基因的重組表達菌株。

4.權利要求3所述重組表達菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)突變體FODt編碼基因的獲得

以Fusarium oxysporum中FODw的cDNA為模板，以引物281F、281R、411F、411R、FODtF和FODtR在氨基酸序列中引入P281E、F411R兩處突變位點；其中，引物281F、281R、411F、411R、FODtF和FODtR的序列如SEQ ID No：3-8所示；

以PCR方式擴增并獲得突變體FODt編碼基因，并在全長序列擴增時引入Eco RI和Not I兩處酶切位點；

PCR反應體系50μL，反應條件為：95℃預變性2min，隨后進行95℃20s，57℃20s，72℃1.5min，30個循環；反應結束后取10μL PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測；以AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將FODt目的片段回收；

(2)重組質粒的構建

以Eco RI和Not I兩種限制內切酶分別在37℃中酶切FODt目的片段和pPIC9K載體，通過AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將兩組酶切產物回收后，各取50-100ng回收產物混合后加入T4連接酶，于16℃環境中將FODt編碼基因正向插入pPIC9K的Eco RI和Not I酶切位點之間，獲得重組質粒；

(3)突變體FODt重組表達菌株的構建

將重組質粒轉入E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，吸取適量轉化產物涂布于LB平板在20-37℃培養；待長出菌落后，隨機挑取部分單克隆，驗證陽性克??；將陽性克隆接種于含有5mL液體LB的試管中，于20-37℃、100-220rpm進行過夜培養后，收取菌體并提取質粒；以SacI限制性內切酶將3-6μg的重組質粒于37℃中充分單酶切，獲得線性化質粒，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將線性化質粒回收；

將回收后線性化的重組質粒以電轉方式轉入P.pastoris GS115感受態細胞中，于20-30℃中以YPD平板進行培養，挑取單菌落并驗證陽性克隆，獲得FODt重組表達菌株；將獲得的重組菌株挑至BMGY培養基中于20-30℃、100-220rpm條件培養后保存于10-30％的甘油管中，放置于-80℃中以保菌。

5.權利要求1所述果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt的制備方法，其特征在于：

將權利要求3所述的重組表達菌株或權利要求4制備的重組表達菌株接種于種子液體培養基中進行發酵，在20-30℃、100-220rpm/min條件下培養至菌體OD₆₀₀＝2～8；將菌體離心后，用發酵液體培養基重懸細胞至OD₆₀₀＝0.5-2.0，每隔24h加入甲醇使其中甲醇濃度為0.3-2.0％；將誘導后的發酵液離心后獲得上清液，即為果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt粗酶液；

將粗酶液在4-10℃、0.1-0.5MPa條件下進行濃縮超濾，獲得濃縮粗酶液；隨后以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在4-10℃進行透析三次；再以DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱對果糖賴氨酸氧化酶進行純化，獲得突變體FODt蛋白，并以凝膠電泳檢測蛋白純度。

6.根據權利要求5所述果糖賴氨酸氧化酶突變體FODt的制備方法，其特征在于：所述種子液體培養基為BMGY，其溶劑為pH值3.5-6.5、0.1M的PBS緩沖液，溶質及其濃度為：YeastExtract 10g/L、Tryptone 20g/L、YNB 13.4g/L、甘油10g/L、生物素4×10^-4g/L。