[發明專利]一種解脂耶氏酵母中基因連續無標記整合系統及應用

在審

• 申請號: 202210974824.3
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115418371A
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 閆云君;焦梁成;李云翀;朱夢琴;李文娟;趙國威;張后今
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/65;C12N15/90
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 孫楊柳

本發明公開了一種解脂耶氏酵母中基因連續無標記整合系統及應用，屬于微生物基因工程領域。本發明整合系統基于Cre/loxP位點特異性重組，首先通過第一型載體轉化宿主完成第一輪基因無標記整合并引入左臂或右臂突變型lox序列，隨后通過交替使用攜帶有兩種特定組合的左臂、右臂突變型lox序列的第二型載體和第三型載體，最終能夠高效地在解脂耶氏酵母基因組單個位點處實現目的基因的連續無標記整合。本發明僅需使用單個酵母篩選標記，且能高效地實現大腸桿菌復制起點與篩選標記、Cre基因表達盒、酵母篩選標記及冗余的同源片段等幾乎所有非必須DNA片段的剔除，使得多個目的基因表達盒能以特定方式在單個基因位點處實現連續無標記整合。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地，涉及一種解脂耶氏酵母中基因連續無標記整合系統及應用。

背景技術

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)隸屬于子囊菌門，其廣泛分布于自然界，尤其是含豐富脂質和蛋白質的環境，作為一種非常規酵母，其擁有諸多獨特的性質。解脂耶氏酵母嚴格需氧，具有典型的二態性，能以多種糖類、醇類、烴類、脂類等廉價物質作為碳源，其體內具有較高的三羧酸循環通量和高效的磷酸戊糖途徑，為諸多天然產物提供了合成所需的前體物質，且被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)認證為GRAS(Generally Recognized as Safe)安全型微生物，是一種應用潛力巨大的微生物底盤。為了提高代謝產物的產量，通常需要對解脂耶氏酵母進行一系列遺傳操作以進行代謝通路改造。解脂耶氏酵母對多種常用的抗生素均不敏感，僅腐草霉素和潮霉素B可用于其抗生素遺傳篩選，且該酵母在使用抗生素篩選時易發生自發突變，而含抗生素基因的重組菌株也不適于應用于食品藥品等生物安全性領域。目前，研究中多使用亮氨酸營養缺陷型和尿嘧啶營養缺陷型篩選標記進行解脂耶氏酵母的遺傳篩選，但其在單個宿主進行多次轉化需要使用或構建多缺陷型宿主，也存在諸多應用局限。可見，解脂耶氏酵母體內可用的篩選標記十分有限，這對該菌株深入的遺傳改造造成了極大的限制。

目前，已有研究利用Cre/loxP位點特異性重組成功在解脂耶氏酵母中實現了無標記基因操作，一定程度上克服了篩選標記不足的難題。Cre/loxP系統中，loxP特異性識別序列含有兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的間隔片段，該間隔片段賦予了loxP重組位點的類別和方向，當同一條DNA片段上含有兩個方向相同的loxP位點時，Cre重組酶可介導其發生切除事件。通過對野生型loxP位點中13bp的反向重復序列進行適當突變，可分別構建如lox71的左臂突變型(LE mutant，LE)和如lox66的右臂突變型(RE mutant，RE)，兩個突變型位點之間反應可產生難以再次發生重組反應的雙臂突變型lox位點(LE+RE mutant，LE+RE)。此外，通過對間隔序列進行適當突變，可獲得間隔序列不同的lox位點(如lox2272)，含有不同間隔序列的兩個lox位點(如lox2272突變體與野生型loxP)之間不能發生重組反應。此前，如Fickers等[New disruption cassettes for rapid gene disruption andmarker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica[J].Journal of microbiologicalmethods,2003,55(3):727-737.]報道的常規方法中利用Cre/loxP重組系統成功在解脂耶氏酵母中實現了酵母篩選標記的剔除，但其loxP位點和Cre重組酶基因表達盒分別位于兩個重組載體或DNA片段，需要使用兩種遺傳篩選標記，且每輪無標記基因整合需進行兩次遺傳轉化，實驗過程相對低效且繁瑣。另外，專利文獻CN201910747704.8中公開了一種使用3個含有不同方向組合的左臂或右臂突變型loxP位點的重組質粒實現解脂耶氏酵母中目的基因多次無標記整合的方法，盡管可行，但該方法每輪無標記基因整合獲得的剔除篩選標記的陽性重組菌株中，有較大比例的菌株中存在目的基因表達盒方向顛倒的情況，而相鄰基因表達盒之間的轉錄方向可能對基因的表達存在一定的干擾，仍需要額外的工作去篩選目的基因表達盒未發生顛倒的目的菌株，這也給實驗造成了諸多不便。