[發(fā)明專利]一種解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210974824.3
• 申請(qǐng)日: 2022-08-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115418371A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆云君;焦梁成;李云翀;朱夢(mèng)琴;李文娟;趙國(guó)威;張后今
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/65;C12N15/90
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 孫楊柳

1.一種解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括第一型載體、第二型載體和第三型載體，該三個(gè)載體均包含待剔除DNA片段；所述待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記、Cre基因誘導(dǎo)表達(dá)盒、大腸桿菌篩選標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)；所述Cre基因誘導(dǎo)表達(dá)盒包括從5’至3’順序的解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、乳糖操縱基因序列l(wèi)acO、Cre基因和終止子；

所述第一型載體包括所述待剔除DNA片段、同源片段A、第一目的基因表達(dá)盒、一對(duì)同向且均具有M型間隔片段的lox序列；所述同源片段A為解脂耶氏酵母宿主基因組中的序列，且內(nèi)部含有至少一個(gè)在所述第一型載體上唯一存在的酶切位點(diǎn)；所述一對(duì)同向且具有M型間隔片段的lox序列分別緊鄰待剔除DNA片段的兩側(cè)，在第一型載體整合入酵母同源片段A位點(diǎn)后，能在Cre重組酶作用下切除待剔除DNA片段并在基因組留下一個(gè)具有M型間隔片段的AloxM序列；當(dāng)所述第一目的基因表達(dá)盒緊鄰所述同源片段A的5’端時(shí)，AloxM為右臂突變型lox序列；當(dāng)所述第一目的基因表達(dá)盒緊鄰所述同源片段A的3’端時(shí)，AloxM為左臂突變型lox序列；

所述第二型載體包括所述待剔除DNA片段、同源片段B、第二目的基因表達(dá)盒、具有N型間隔片段的左臂或右臂突變型lox序列AloxN、具有M型間隔片段的左臂或右臂突變型lox序列BloxM；所述同源片段B為解脂耶氏酵母宿主基因組中的序列，且其內(nèi)部應(yīng)含有至少一個(gè)在所述第二型載體上唯一存在的酶切位點(diǎn)；當(dāng)所述第一目的基因表達(dá)盒緊鄰所述第一型載體中所述同源片段A的5’端時(shí)，同源片段B為基因組上同源片段A的5’端緊鄰的片段；當(dāng)?shù)谝荒康幕虮磉_(dá)盒緊鄰第一型載體中同源片段A的3’端時(shí)，同源片段B為基因組上同源片段A的3’端緊鄰的片段；所述AloxN和BloxM序列分別緊鄰第二目的基因表達(dá)盒的兩端，且BloxM序列的另一端與待剔除DNA片段緊鄰，而AloxN序列的另一端與同源片段B緊鄰；所述第二型載體整合入酵母同源片段B位點(diǎn)后，BloxM能與第一型載體整合后留下的AloxM序列之間發(fā)生重組反應(yīng)去除待剔除DNA片段并在基因組上生成雙臂突變型lox序列；

所述第三型載體包括所述待剔除DNA片段、所述同源片段B、第三目的基因表達(dá)盒、具有N型間隔片段的左臂或右臂突變型lox序列BloxN、所述具有M型間隔片段的左臂或右臂突變型AloxM序列；所述同源片段B內(nèi)部含有至少一個(gè)在所述第三型載體上唯一存在的酶切位點(diǎn)；所述BloxN和AloxM序列分別緊鄰第三目的基因表達(dá)盒的兩端，且BloxN序列的另一端與待剔除DNA片段緊鄰，而AloxM序列的另一端與同源片段B緊鄰；所述第三型載體整合入酵母同源片段B位點(diǎn)后，BloxN能與第二型載體整合后留下的AloxN序列之間發(fā)生重組反應(yīng)去除待剔除DNA片段并在基因組上生成雙臂突變型lox序列；

所述具有M型間隔片段的lox序列不能與具有N型間隔片段的lox序列之間發(fā)生重組反應(yīng)。

2.如權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述第一目的基因表達(dá)盒、第二目的基因表達(dá)盒以及第三目的基因表達(dá)盒為相同基因或不同基因的表達(dá)盒。

3.如權(quán)利要求1或2所述的解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述第一目的基因表達(dá)盒、第二目的基因表達(dá)盒以及第三目的基因表達(dá)盒為含有單拷貝或多拷貝基因的表達(dá)盒。

4.如權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記為抗生素篩選標(biāo)記或營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記。

5.如權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為pPOX2油酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

6.如權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述同源片段A和同源片段B的長(zhǎng)度不小于500bp。

7.如權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母中基因連續(xù)無(wú)標(biāo)記整合系統(tǒng)，其特征在于，所述第一目的基因表達(dá)盒、第二目的基因表達(dá)盒和第三目的基因表達(dá)盒中至少一個(gè)表達(dá)盒的兩端緊鄰一對(duì)分別在對(duì)應(yīng)載體上唯一存在的同尾酶，用于體外構(gòu)建含多個(gè)基因表達(dá)盒的整合載體。