[發(fā)明專利]一種通過阻遏子降低谷氨酸棒桿菌基因表達的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210973130.8
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115786383A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐美娟;饒志明;江安;楊套偉;張顯
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/67;C12N1/21;C12N15/31;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發(fā)明公開了一種通過阻遏子降低谷氨酸棒桿菌基因表達的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過選擇兩種異源、正交的阻遏蛋白BetI和LmrA，設(shè)計5’UTR文庫設(shè)計，并通過綠色熒光蛋白熒光強度驗證，得到兩種具有梯度表達強度的阻遏子文庫，能夠?qū)崿F(xiàn)在谷氨酸棒桿菌中多個靶基因表達水平的精細(xì)化下調(diào)和平衡代謝流分布，突破了原來只能通過基因敲除的手段來實現(xiàn)對細(xì)胞基因型的改變。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過阻遏子降低谷氨酸棒桿菌基因表達的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

敲除競爭性途徑或過度表達與化學(xué)品合成相關(guān)的基因的代謝工程策略，已成功應(yīng)用于各種化學(xué)品的生產(chǎn)。然而這種策略對代謝通量的控制不夠精確，無法應(yīng)用于調(diào)節(jié)生長所必需的代謝，例如能量和輔助因子的形成，以及初級代謝物的合成。而合成生物學(xué)的最新發(fā)展使得微調(diào)代謝通量成為可能。通過挖掘和利用各種基因元件，已經(jīng)進行了大量研究，以實現(xiàn)對目標(biāo)代謝通量的精細(xì)調(diào)控。例如通過遺傳調(diào)控子和同源啟動子的不同親和力的配對和挖掘，可以動態(tài)調(diào)控靶基因的表達。然而該策略只能針對特定基因的表達調(diào)控，難以應(yīng)用于其他基因。任何基因要實現(xiàn)其調(diào)控，都必須確定合適的強度并提高其表達水平，這是一個耗時的過程。此外，CRISPRi已作為一種有效的基因表達下調(diào)策略應(yīng)用于各種化學(xué)品的生物合成。然而由于PAM序列的要求和gRNA的復(fù)雜設(shè)計，難以實現(xiàn)高效、正交的多基因調(diào)控，并且在使用范圍上存在一定的局限性。為了克服上述問題，成功開發(fā)了一種使用具有不同表達水平的正交阻遏子文庫的策略。其原理是將阻遏蛋白的同源啟動子插入到目標(biāo)基因的上游，然后通過引入不同表達水平的阻遏蛋白，并從中選擇最佳突變體，實現(xiàn)目標(biāo)基因的不同水平表達。為代謝工程細(xì)胞工廠合成化學(xué)品提供了一種新的可靠方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種通過阻遏子文庫弱化谷氨酸棒桿菌基因表達的方法。

本發(fā)明提供了一種調(diào)控目的基因表達的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括響應(yīng)模塊和結(jié)合模塊；

所述結(jié)合模塊為：在目的基因上游插入的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的阻遏蛋白BetI結(jié)合序列；所述響應(yīng)模塊為：偶聯(lián)了阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的阻遏蛋白基因betI；所述阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～7任一所示，所述阻遏蛋白基因betI的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

本發(fā)明提供了一種調(diào)控目的基因表達的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括響應(yīng)模塊和結(jié)合模塊；所述結(jié)合模塊為：在目的基因上游插入的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的阻遏蛋白LmrA結(jié)合序列；所述響應(yīng)模塊為：偶聯(lián)了阻遏蛋白LmrA的5’UTR序列的阻遏蛋白基因lmrA；所述阻遏蛋白LmrA的5’UTR序列核苷酸序列如SEQ ID NO.8～14任一所示，所述阻遏蛋白基因lmrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

本發(fā)明還提供了一種上述調(diào)控目的基因表達的系統(tǒng)在重組菌中降低基因表達中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用為，將所述阻遏蛋白BetI結(jié)合序列置于重組菌基因組上需降低其表達的目的基因的啟動子下游；

同時，采用表達載體游離表達偶聯(lián)了阻遏蛋白BetI的5’UTR序列的阻遏蛋白基因betI。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用為，將所述阻遏蛋白LmrA結(jié)合序列置于重組菌基因組上需降低其表達的目的基因的啟動子下游；

同時，采用表達載體游離表達偶聯(lián)了阻遏蛋白LmrA的5’UTR序列的阻遏蛋白基因lmrA。

本發(fā)明還提供了一種含有上述調(diào)控目的基因表達的系統(tǒng)的重組菌。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌以細(xì)菌或真菌為宿主細(xì)胞。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主細(xì)胞為谷氨酸棒桿菌。