[發明專利]一種基于動態高壓微射流結合高效液相色譜技術分析活性乳清蛋白含量的方法

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• 申請號: 202210970308.3
• 申請日: 2022-08-12
• 公開（公告）號: CN115480002A
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發明（設計）人: 俞蘭秀;黃彩娟;楊郁葒
• 申請（專利權）人: 卡士乳業（深圳）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林宇然

本發明涉及一種基于動態高壓微射流結合高效液相色譜技術分析活性乳清蛋白含量的方法，屬于檢測分析技術領域；以高效液相色譜技術為基礎，結合動態高壓微射流技術對樣品進行前處理，破壞酪蛋白和乳清蛋白之間，以及蛋白質和其它成份之間的非特異性結合，進而采用高效液相色譜法進行測定。即以多孔性填料為固定相，依據樣品組分對固定相和流動相的分配系數的差別進行分離，同時實現幾種活性乳清蛋白的定量分析，建立一種快速簡便、準確的檢測活性乳清蛋白含量的方法。

技術領域

本發明屬于檢測分析的技術領域，更具體地，涉及一種基于動態高壓微射流結合高效液相色譜技術分析活性乳清蛋白含量的方法。

背景技術

牛乳中乳清蛋白含量約占牛乳總蛋白的20％。乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白(α-LA)、β-乳球蛋白(β-LG)和乳鐵蛋白(LF)等。研究發現，乳清蛋白中的氨基酸比例極佳，具有較高的營養價值，有“蛋白之王”的美稱。α-LA是乳清蛋白中的主要蛋白質之一。α-LA在牛乳中占總蛋白含量的2％～3％，在母乳中占總蛋白含量的20％～25％。牛奶乳清蛋白中約50％是β-LG，β-LG含有一個疏水核心，是由8個反平行的β-鏈折疊形成的花萼狀結構，可以結合許多小分子物質。單體中的Cys-106到Cys-119和Cys-66到Cys-160，這兩個二硫鍵維持了β-LG的結構完整性。牛乳鐵蛋白是牛乳及其制品中重要的功能蛋白之一。我國牛乳和乳制品的消費正逐年加大。乳業專家提出，應強化牛乳鐵蛋白在乳制品、營養保健品和藥品中的應用。現有對這幾種乳清中的活性蛋白質的定量檢測方法主要有酶聯免疫法和高效液相色譜法等。然而常規的乳樣品中，乳清蛋白與酪蛋白緊密結合在一起，在采用高效液相色譜法進行檢測之前，需要先沉淀酪蛋白，分離出乳清蛋白，才能實現定量分析的目的。但是沉淀酪蛋白較低的可控性和重復性嚴重影響了樣品檢測的穩定性。造成了檢測成本較高，試劑使用量大，操作復雜，重現性不好等一系列問題。

發明內容

針對上述現有的技術問題，本發明的目的在于提供一種分析活性乳清蛋白含量的方法。本發明以色譜技術為基礎，結合動態高壓微射流技術對樣品進行前處理，破壞蛋白質之間以及蛋白質和其它成份之間的非特異性結合，進而采用高效液相色譜法進行測定，依據樣品組分對固定相和流動相的分配系數的差別進行分離，同時實現幾種活性乳清蛋白的定量分析，建立一種快速簡便、準確的檢測活性乳清蛋白含量的方法。為評價原料乳及巴氏殺菌乳的品質提供快速穩定檢測方法，并為相關乳制品開發提供數據支撐。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：

一種基于動態高壓微射流結合高效液相色譜技術分析乳清蛋白含量的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：(1)準確稱取乳樣品100.00克，在4℃條件下經5000g離心20min，或7000g離心20min，或9000g離心20min，或11000g離心20min脫脂；(2)由步驟(1)得到的樣品取中間清液，用去離子水稀釋2倍，或4倍，或6倍；(3)將由步驟(2)得到的樣品進行動態高壓微射流處理：進行20MPa處理一次，或20MPa處理兩次，或20MPa處理三次，或40MPa處理一次，或40MPa處理兩次，或40MPa處理三次，或60MPa處理一次，或60MPa處理兩次，或60MPa處理三次；(4)過0.22μm水系濾膜，進行高效液相色譜分析，色譜柱為gel2000SWXL300 mm×7.8nm或C18柱(4.6mm×250mm)，所述的流動相為0.1mol/L NaNO₃(pH7.0)溶液和0.1mol/L Na₃PO₄-Na₂SO₄(pH6.7)緩沖液，或0.2mol/L Na₃PO₄(pH 7.0)緩沖液，或0.1％三氟乙酸溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液；柱溫為35℃或25℃，進樣量為10μL，高效液相色譜檢測器為紫外檢測器，檢測波長為214nm，或220nm，或230nm，或254nm，或280nm；(5)根據標準曲線獲得樣品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的含量。

優選地，所述的離心脫脂條件為：樣品經7000g離心20min。