[發(fā)明專利]一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210966122.0
• 申請(qǐng)日: 2022-08-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115786150A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳勇;王斯楠;應(yīng)漢杰;余斌;王詩(shī)萌;陳天鵬;孫文俊;朱家慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N9/38;C12N15/31;C12N15/56;C12N15/81;C12P19/14;C12P19/00;C12R1/84
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 仲凌霞;肖明芳

本發(fā)明公開(kāi)了一種表面展示β?半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用，所述重組畢赤酵母菌是在原始畢赤酵母Pichia pastoris GS115中異源表達(dá)來(lái)源于米曲霉BK03的β?半乳糖苷酶基因lacA與來(lái)源于釀酒酵母的細(xì)胞壁蛋白Flo1p。本發(fā)明通過(guò)將β?半乳糖苷酶通過(guò)表面展示技術(shù)展示在細(xì)胞表面，酶的穩(wěn)定性更好；同時(shí)，β?半乳糖苷酶能夠更多次地被重復(fù)利用，產(chǎn)低聚半乳糖的量較高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶的基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種表面展示來(lái)源于米曲霉的β-半乳糖苷酶lacA的重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

表面展示是一種利用錨定蛋白將外源靶蛋白展示在細(xì)胞表面的技術(shù)。酵母菌株是眾所周知的安全性菌株，酵母是真核生物，具有真核細(xì)胞蛋白質(zhì)折疊、mRNA加工、蛋白水解、糖基化和異構(gòu)化等功能。酵母表面展示技術(shù)是通過(guò)外源靶蛋白基因與特定的錨定蛋白基因融合形成融合蛋白，連入相關(guān)載體并導(dǎo)入酵母細(xì)胞，在酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的引導(dǎo)下將靶蛋白表達(dá)定位于酵母細(xì)胞表面。通常選擇細(xì)胞壁外層的甘露糖蛋白充當(dāng)錨定蛋白，外源靶蛋白和錨定蛋白主要有兩種融合方式：C端融合和N端融合。用錨定蛋白將外源蛋白展示在細(xì)胞表面，穩(wěn)定性良好。β-半乳糖苷酶在醫(yī)學(xué)、食品等方面應(yīng)用廣泛，畢赤酵母表面展示系統(tǒng)有良好的發(fā)展前景，用錨定蛋白將來(lái)源于米曲霉的β-半乳糖苷酶lacA展示在畢赤酵母細(xì)胞表面，其展示的酶比較穩(wěn)定，適合充當(dāng)全細(xì)胞催化劑，近些年來(lái)對(duì)畢赤酵母表面展示系統(tǒng)的研究越來(lái)越多。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)際要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)方法。

本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用。

發(fā)明思路：本發(fā)明旨在通過(guò)酵母表面展示技術(shù)將來(lái)源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶lacA基因展示表達(dá)在原始畢赤酵母Pichia pastoris GS115細(xì)胞表面，獲得一株能夠合成低聚半乳糖的重組畢赤酵母菌株。通過(guò)對(duì)重組菌株固定化細(xì)胞固定化酶的研究，測(cè)定酶活和產(chǎn)量變化，獲得一株高產(chǎn)低聚半乳糖的畢赤酵母表面展示菌株。

為了解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌，在原始畢赤酵母Pichia pastoris GS115中異源表達(dá)來(lái)源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA與來(lái)源于釀酒酵母的細(xì)胞壁蛋白Flo1p。

其中，所述β-半乳糖苷酶基因lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述細(xì)胞壁蛋白Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了上述重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法，在原始畢赤酵母Pichia pastoris GS115中導(dǎo)入攜帶Flo1p和lacA的重組質(zhì)粒pPIC9k-Flo1p-lacA。

具體地，所述畢赤酵母表面展示β-半乳糖苷酶lacA重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：

(1)以釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的基因組為模板構(gòu)建錨定蛋白Flo1p的表面展示表達(dá)原件；