[發(fā)明專利]一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210966122.0
• 申請(qǐng)日: 2022-08-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115786150A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳勇;王斯楠;應(yīng)漢杰;余斌;王詩(shī)萌;陳天鵬;孫文俊;朱家慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N9/38;C12N15/31;C12N15/56;C12N15/81;C12P19/14;C12P19/00;C12R1/84
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 仲凌霞;肖明芳

1.一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌，其特征在于，在原始畢赤酵母Pichia pastoris GS115中異源表達(dá)來(lái)源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA與來(lái)源于釀酒酵母的細(xì)胞壁蛋白Flo1p。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母菌，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶基因lacA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母菌，其特征在于，所述細(xì)胞壁蛋白Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法，其特征在于，在原始畢赤酵母Pichiapastoris GS115中導(dǎo)入攜帶Flo1p和lacA的重組質(zhì)粒pPIC9k-Flo1p-lacA。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pPIC9k-Flo1p-lacA核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將所述重組畢赤酵母菌的種子液接種到BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為2～6；

(2)將步驟(1)培養(yǎng)好的BMGY離心，所得沉淀接種到BMMY培養(yǎng)基中發(fā)酵，加入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟(1)中，所述BMGY培養(yǎng)基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、100mL/L磷酸鉀母液、2mL/L生物素母液、100mL/L 10％甘油、100mL/L YNB母液，溶劑為純水。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟(2)中，所述BMMY培養(yǎng)基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、100mL/L磷酸鉀母液、2mL/L生物素母液、100mL/L YNB母液、5mL/L甲醇，溶劑為純水。

9.權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述表面展示β-半乳糖苷酶的重組畢赤酵母菌在發(fā)酵產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，將所述重組畢赤酵母種子液接種于畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體，然后以乳糖為底物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化，得到低聚半乳糖。