[發明專利]一種應用iTRAQ技術鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法

在審

• 申請號: 202210960609.8
• 申請日: 2022-08-11
• 公開（公告）號: CN115343407A
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 張九凱;陳穎;倪雪;邢冉冉;鄧婷婷;于寧
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/72;G01N30/06
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 丁敬博

本發明涉及一種鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法，該方法采用iTRAQ技術對冰鮮和凍融處理三文魚中的蛋白進行定量和定性分析，篩選出與三文魚凍融后品質變化相關的差異蛋白，并利用多反應檢測模式對這些蛋白做了進一步驗證，為解釋凍融處理后的三文魚品質變化規律奠定了理論基礎。本發明的鑒別方法為三文魚品質評價和控制提供了研究思路和科學依據，也為進口的三文魚品質鑒別提供了技術支持。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體涉及一種應用iTRAQ技術鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法。

背景技術

在眾多生食魚片中，三文魚憑借其顏色鮮艷、肉質細嫩、肥而不膩的口感和豐富的營養價值，成為眾多消費者的首選。日式料理店中的三文魚刺身、超市中銷售的可生食三文魚肉等都需要經過冷鏈物流的運輸。特別是冰鮮三文魚，需要在捕撈后短時間內將溫度降到0℃左右，隨即包裝運輸，在運輸和存儲過程中，均嚴格控制在一定的溫度范圍內。溫度始終處于冰點臨界點，以保持肉質的柔軟，同時適當的低溫又能防止細菌繁殖，如此一來口感和營養都最大程度地保留了下來，保持了三文魚細胞活體狀態和食用口味鮮美。但這需要盡快從生產地運達目的地，導致物流成本較高，因此一些商家為了降低運輸成本，延長保存時間，會將三文魚進行冷凍運輸，在這個過程中，細胞內部分水凍結形成冰晶，體積增加，從而引起細胞膜刺穿、破裂及部分肌肉纖維空間結構損傷；然后在解凍過程中，因細胞膜和肌纖維的損壞，導致體內大量的營養物質伴隨著汁液流失而減少。因此，相比冰鮮三文魚，凍融后的三文魚口感較差、營養損失較多，市場價值也就大打折扣，且潛在的寄生蟲和病原菌微生物還對消費者的身體健康帶來嚴重威脅。

針對市場上凍融三文魚“以次充好”的現象，有必要對其進行檢測。傳統的凍融魚類鑒別技術有感官評價、微生物檢測和理化分析，但感官識別技術需要依靠專業的人員，且評價結果具有一定的主觀性，而微生物和理化方法操作復雜。相比于以上技術，光譜技術和電子鼻、電子舌等無損檢測技術克服了其操作復雜、消耗時間長的缺點，可以通過建立不同的判別模型，來實現對新鮮和凍融樣品的精準鑒別。但這些技術只能從變化終端入手，無法深入了解凍融處理后三文魚品質機理方面的變化過程。

反復凍融對三文魚品質方面的影響有很多，其中蛋白質作為魚類肌肉組織的主要成分之一，其結構與功能特性對魚類品質的影響較為顯著，而質譜和蛋白組學研究技術的不斷發展為進一步探究凍融后三文魚品質變化的機理提供了技術支持。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術是一種多肽體外標記技術。該技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經高分辨率質譜儀分析，可同時比較多達8個樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術，同時結合生物信息學分析可進一步探明凍融處理后三文魚品質機制。

因此尚未見應用iTRAQ技術鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚方法的相關報道。

發明內容

本發明的目的是針對目前中國市場上三文魚標簽混亂、以次充好等現象，提供一種應用iTRAQ技術鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法，通過iTRAQ蛋白組學技術，進一步結合MRM驗證，對冰鮮和凍融的三文魚中蛋白進行定量和定性分析，獲得冰鮮和凍融三文魚蛋白組的變化。

針對上述目的，本發明第一方面提供一種應用iTRAQ技術鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法，其包含以下步驟：

(1)采集冰鮮和凍融處理的三文魚樣品，提取樣品中的蛋白；

(2)對步驟(1)獲得的蛋白質樣品進行酶解、iTRAQ標記、分離肽段及LC-MS質譜分析；

(3)對步驟(2)獲得的蛋白質譜數據進行定性和定量分析，篩選兩次重復數據進行t-test檢驗，p值小于0.05的蛋白，以及差異倍數(Fold change)1.2或0.83的差異蛋白進行功能注釋和代謝通路分析；