[發(fā)明專利]一種應(yīng)用iTRAQ技術(shù)鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210960609.8
• 申請日: 2022-08-11
• 公開（公告）號: CN115343407A
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張九凱;陳穎;倪雪;邢冉冉;鄧婷婷;于寧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/72;G01N30/06
• 代理公司: 北京天盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421
• 代理人: 丁敬博

1.一種應(yīng)用iTRAQ技術(shù)鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)采集冰鮮和凍融處理的三文魚樣品，提取樣品中的蛋白；

(2)對步驟(1)獲得的蛋白質(zhì)樣品進行酶解、iTRAQ標(biāo)記、分離肽段及LC-MS質(zhì)譜分析；

(3)對步驟(2)獲得的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行定性和定量分析，篩選兩次重復(fù)數(shù)據(jù)進行t-test檢驗，p值小于0.05的蛋白，以及差異倍數(shù)(Fold change)1.2或0.83的差異蛋白進行功能注釋和代謝通路分析；

(4)對步驟(3)所得差異蛋白進行MRM驗證，獲取冰鮮和凍融三文魚蛋白組的變化情況。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中提取三文魚蛋白的方法為尿素法，并用Bradford法測定蛋白濃度。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中是在肽段定量后各組樣品按照試劑盒說明書進行酶切、肽段標(biāo)記后進行分級，并進行質(zhì)譜鑒定。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中采用Durashell-C 18色譜柱對標(biāo)記后的肽段進行分級，將分級后的肽段用流動相A溶解后上樣到液質(zhì)聯(lián)用儀，進行梯度洗脫并進行質(zhì)譜檢測，其中流動相A為含有0.1％甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1％甲酸和2％水的乙腈溶液，流動相流速為0.265mL/min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中質(zhì)譜條件為：采用正離子掃描模式，掃描范圍350-1500m/z；霧化器(GS1)：50psi；輔助加熱氣(GS2)：50psi；氣簾氣(CUR)：35psi；離子源溫度(TEM)：550℃；去簇電壓(DP)：80V；離子碰撞能量(CE)：10V。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中蛋白數(shù)據(jù)處理是使用ProteinPilot 5.0.2軟件對質(zhì)譜結(jié)果進行統(tǒng)一和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，三文魚物種原始蛋白庫于Uniprot上進行下載。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中功能注釋的方法為：利用歐洲生物信息研究所維護的QuickGO注釋工具對差異蛋白進行基因本體功能注釋；所述步驟(3)中代謝通路分析的方法為：利用京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質(zhì)進行代謝通路分析。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中MRM驗證的具體步驟為：利用Triple-TOF 6600質(zhì)譜對冰鮮和凍融三文魚肌肉全蛋白分別進行掃描，ProteinPilot5.0.2軟件進行搜庫，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化，找到已鑒定的目標(biāo)差異蛋白的肽段，利用Skyline軟件構(gòu)建離子對，其中每個肽段選取3-6個離子對使用Nexera X2液相色譜儀串聯(lián)QTrap-5500質(zhì)譜進行MRM驗證；然后選取3個響應(yīng)高、質(zhì)荷比在150-1250m/z之間的離子對進行定量，對比差異蛋白變化倍數(shù)和離子對峰面積變化倍數(shù)。

9.一種鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚的生物標(biāo)志物組合物，其特征在于，所述生物標(biāo)志物組合物包括UniProt登錄號為B5DGE7、B9ELE8、B5RI29、A0A1S3PT89、B5DGT9、B5DG55、A0A1S3KKP9、B5DGL3、A0A1S3M1A4、C0PUH3、A0A1S3KNT1、A0A1S3QRR9、A0A1S3NGD5、B5DG30、B5DFT9、B5DGZ1、B5DH07、A0A1S2X0C2、A0A1S3R5J0和B5DH17中的一種或多種蛋白。

10.權(quán)利要求9所述的生物標(biāo)志物組合物在鑒別冰鮮三文魚和凍融三文魚方面的應(yīng)用。