[發(fā)明專利]增強(qiáng)α-突觸核蛋白聚集體對(duì)細(xì)胞膜破壞能力的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210947299.6
• 申請(qǐng)日: 2022-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN115469101A
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳敏;羅漢將;胡勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/532;G01N33/561;G01N33/577;G01N33/58;C12Q1/02;G01N15/02;G01N15/08;G01N21/31;G01N21/64;G01N21/75;G01N23/04;G01N23/20
• 代理公司: 廣西中知華譽(yù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45140
• 代理人: 吳震輝

本發(fā)明公開了增強(qiáng)α?突觸核蛋白(α?Syn)聚集體對(duì)細(xì)胞膜破壞能力的方法，將140μL0.01M PBS溶解1mg重組人α?Syn，然后分別添加70μL PBS、健康人員、PD患者血漿在37℃環(huán)境下恒溫振蕩孵育4天，以酸性磷脂1?棕櫚酰基?2?油酰基?sn?甘油?3?磷酸?L?絲氨酸(POPS)為原料，采用薄膜分散?超聲法制備小單室脂質(zhì)體(SUVs)，將不同濃度的蛋白分別與SUVs及SH?SY5Y細(xì)胞孵育，通過鈣黃綠素泄露實(shí)驗(yàn)觀察不同條件下形成的α?Syn聚集體對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力。結(jié)果表明結(jié)果表明PD患者血漿孵育形成的α?Syn聚集體對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力更強(qiáng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于α-突觸核蛋白聚集體技術(shù)領(lǐng)域，涉及增強(qiáng)α-突觸核蛋白聚集體對(duì)細(xì)胞膜破壞能力的方法。

【背景技術(shù)】

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以運(yùn)動(dòng)障礙為常見臨床表現(xiàn)的α-突觸核蛋白病，它病理特點(diǎn)是中腦黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的大量進(jìn)行性丟失，以及殘存神經(jīng)元胞體內(nèi)存在由α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)異常聚集組成的包涵體-路易小體(Lewy bodies，LBs)。PD的臨床表現(xiàn)主要為行為遲緩、靜止性震顫等運(yùn)動(dòng)癥狀和精神、認(rèn)知障礙和感覺障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀。

α-Syn是由140個(gè)氨基酸組成的可溶性蛋白質(zhì)，多以單體形式分布在突觸前末梢。在生理?xiàng)l件下，α-Syn主要以無序狀態(tài)和α-螺旋狀態(tài)存在；而在病理?xiàng)l件下，α-Syn容易發(fā)生聚集，首先形成可溶性低聚物，進(jìn)而組裝成有序的、富含β-折疊的不溶性淀粉樣原纖維，進(jìn)一步聚集形成細(xì)胞內(nèi)包涵體，成為突觸核蛋白病的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果顯示，不同突觸核蛋白病的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性存在差異，如與PD的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)路易小體(Lewy bodies，LBs)相比，MSA的標(biāo)志性病理結(jié)構(gòu)膠質(zhì)胞漿包涵體(Glial cytoplasmicinclusions， GCIs)對(duì)蛋白酶K(Proteinase K，PK)具有更強(qiáng)的抵抗力，且GCIs來源的α-Syn可造成小鼠產(chǎn)生更嚴(yán)重的神經(jīng)病理改變，提示兩者的α-Syn可能具有不同的蛋白構(gòu)象。α-Syn構(gòu)象狀態(tài)受pH、溫度、離子強(qiáng)度和粘度等影響，可在體內(nèi)、外可進(jìn)行自組裝并聚集，而形成的聚集體可以“種子”的形式，發(fā)生類似朊病毒樣的播散。

目前已有α-突觸核蛋白的研究，例如中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朇N201610801424.7原細(xì)纖維結(jié)合抗體及其治療和診斷帕金森氏癥、路易體癡呆和其他α-共核蛋白病的應(yīng)用，抗體及其片段具有對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合，組合物包含這樣的抗體或片段，利用這樣的抗體或片段來檢測(cè)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維；預(yù)防、推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作或治療所述疾病；制備治療具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的藥物組合物；診斷或監(jiān)測(cè)具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病進(jìn)展，以及減少或抑制α-突觸核蛋白聚集。

α-Syn聚集體是PD發(fā)病過程中的主要的神經(jīng)毒性物質(zhì)，其神經(jīng)毒性與其對(duì)細(xì)胞膜通透性損傷及其細(xì)胞間轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并通過進(jìn)一步造成溶酶體、高爾基體和線粒體等細(xì)胞器膜損傷而導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。現(xiàn)有研究結(jié)果認(rèn)為，α-Syn聚集體通過改變脂質(zhì)膜的通透性，破壞鈣穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞退變。α-Syn聚集體通過其富含β- 片段的區(qū)域插入脂質(zhì)雙分子層干擾細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)，形成細(xì)胞膜孔隙狀結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的通透性，出現(xiàn)鈣內(nèi)流異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。有研究結(jié)果顯示，α-Syn毒性聚集體的形成與特定的細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)，PD患者血漿代謝環(huán)境能促進(jìn)α-Syn聚集體的形成，但其孵育形成的聚集體對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用還未可知。

【發(fā)明內(nèi)容】

針對(duì)現(xiàn)有研究中，對(duì)于α-Syn毒性聚集體的形成與特定的細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)，PD患者血漿代謝環(huán)境能促進(jìn)α-Syn聚集體的形成，但其孵育形成的聚集體對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用還未可知的問題，本發(fā)明提供了增強(qiáng)α-突觸核蛋白聚集體對(duì)細(xì)胞膜破壞能力的方法，為后續(xù)在人工脂質(zhì)膜和細(xì)胞膜水平比較磷酸鹽緩沖液(PBS)、健康人群血漿(HC)、PD患者血漿孵育的α-Syn 聚集體對(duì)細(xì)胞膜破壞能力的差異提供了基礎(chǔ)。