[發(fā)明專利]增強α-突觸核蛋白聚集體對細胞膜破壞能力的方法

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• 申請日: 2022-08-09
• 公開（公告）號: CN115469101A
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設計）人: 陳敏;羅漢將;胡勇
• 申請（專利權）人: 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/532;G01N33/561;G01N33/577;G01N33/58;C12Q1/02;G01N15/02;G01N15/08;G01N21/31;G01N21/64;G01N21/75;G01N23/04;G01N23/20
• 代理公司: 廣西中知華譽知識產權代理有限公司 45140
• 代理人: 吳震輝

1.增強α-突觸核蛋白聚集體對細胞膜破壞能力的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)α-Syn聚集體的制備：使用140μL 0.01M PBS溶解1mg重組人α-Syn，然后分別添加70μL磷酸鹽緩沖液、健康人群血漿、帕金森病患者血漿，使α-Syn的終濃度為2μg/μL，并添加防腐劑防止蛋白細菌生長，于恒溫振蕩混勻儀中在37℃、1800g條件下振蕩孵育4天，分裝保存于-80℃；

2)Western blot法檢測分析各組α-Syn聚集體的形成差異：400ng的磷酸鹽緩沖液組、健康人群血漿組、帕金森病患者血漿組α-Syn聚集體通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉移至PVDF膜上，5％的脫脂奶粉室溫封閉90分鐘后孵育抗α-Syn單克隆抗體2小時，進一步室溫孵育山羊抗小鼠熒光二抗1小時，于ODYSSEY雙色紅外熒光成像系統(tǒng)下掃膜成像，利用Image J軟件對蛋白條帶進行定量灰度分析，比較不同條件下形成的α-Syn聚集體的聚集差異；

3)包裹100mM鈣黃綠素的小單室脂質體的制備：10mL三氯甲烷溶解400μL 10mg/mL的酸性磷脂1-棕櫚酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸，水浴超聲30分鐘，置入旋轉蒸發(fā)儀30℃減壓蒸發(fā)30分鐘制得一層脂質薄膜；加入5mL含100mM鈣黃綠素的25mM PBS溶液，30℃旋轉水化1小時；冰浴超聲，超聲功率300W，超聲5秒停5秒，超聲10分鐘，3次，每次間歇10分鐘；2000Da透析袋透析SUVs，去除游離的鈣黃綠素；

4)利用馬爾文納米粒度電位儀及透射電鏡分析粒徑及形態(tài)：取1mL制備好的SUVs上機檢測分析SUVs的粒徑大小及分布情況；

5)采用負染色法在透射電鏡下對SUVs進行成像：

親水化處理：滴加10μL 1g/L的BSA溶液在碳膜包裹的銅載網的支持面上1分鐘，吸去多余液體；

樣品的吸附：滴加5μL SUVs樣品于銅載網的支持面，保留3分鐘，重復加樣5次；

清洗：滴加5μL 25mM PBS于載網上，保留10-15秒，重復2次；

負染色：滴加5μL 3％的醋酸雙氧鈾于載網上，迅速吸走，重復3次，最后一次保留1分鐘，置于紅外燈下干燥，于透射電鏡下成像；

6)SUVs透析后的鈣黃綠素釋放比值測定：在激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為535nm下，測定透析不同時間后，1％Triton X-100處理與未處理SUVs的100％染料泄露熒光強度F_Triton及原始熒光強度F_Con，根據公式％鈣黃綠素釋放＝(F_Triton/F_Con)×100計算透析后鈣黃綠素釋放比值；

7)不同濃度SUVs鈣黃綠素釋放比值測定：脂質濃度設置為5μM、10μM、20μM、40μM、80μM，在激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為535nm下，測定不同透析時間后，1％Triton X-100處理與未處理SUVs的100％染料泄露熒光強度F_Triton及原始熒光強度F_Con，根據公式％鈣黃綠素釋放＝(F_Triton/F_Con)×100計算透析后鈣黃綠素釋放比例；

8)蛋白處理人工SUVs的鈣黃綠素釋放比值測定：將PBS、健康人群血漿、帕金森病患者血漿孵育的α-Syn蛋白分別加入到5μM SUVs中，使蛋白終濃度分別為0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM及16μM，常溫孵育2小時，在激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為535nm下檢測熒光強度值；根據公式％鈣黃綠素釋放＝(F-F₀/F_Triton-F₀)×100計算釋放比值，其中F_Triton為1％Triton X-100破壞SUVs獲得100％染料泄露的熒光強度值，F為各組α-Syn聚集體處理后測得熒光強度值，F₀為不加蛋白的SUVs背景熒光值；

9)細胞培養(yǎng)：10000個/孔SH-SY5Y細胞接種于多聚賴氨酸包被的96孔細胞培養(yǎng)板中，使用含10％FBS、1％P-S的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、含5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

10)細胞膜內鈣黃綠素滲透實驗：100μL 2μM鈣黃綠素-AM工作液孵育細胞，37℃避光30分鐘，添加不同濃度各組α-Syn聚集體并繼續(xù)避光孵育1小時，PBS漂洗細胞1次，于激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為535nm下記錄熒光強度值；根據公式％細胞內鈣黃綠素＝(F-F₀/F_Con-F₀)×100計算鈣黃綠素釋放比值，其中F為各組測得的熒光值，F₀為背景熒光值，F_Con為Con組測得的熒光值，并利用倒置熒光顯微鏡進行細胞成像；

11)MTS法測定細胞活力：8μM的各組α-Syn聚集體處理細胞48小時后，每孔加入20μLMTS溶液，37℃孵育1小時，于490nm波長處測定吸光度值；

12)統(tǒng)計學方法：采用SPSS 17.0軟件進行數據統(tǒng)計及分析，采用Image J及GraphPadPrism 9.0軟件作圖，正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差，x±s，表示，組間比較采用單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。