[發(fā)明專利]解淀粉芽孢桿菌來源的溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210945725.2
• 申請日: 2022-08-08
• 公開（公告）號: CN116064522A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅正山;徐虹;朱逸凡;嚴(yán)一凡;杜姍姍;李莎;王瑞
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/07
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了解淀粉芽孢桿菌來源的溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明運(yùn)用基因工程手段，從解淀粉芽孢桿菌基因組中篩選獲得了核苷酸序列分別如SEQ?IDNO.1～10所示的內(nèi)源啟動(dòng)子，響應(yīng)范圍在2?22倍之間，并通過電擊轉(zhuǎn)化的方式使帶有啟動(dòng)子的報(bào)告基因成功在解淀粉芽孢桿菌中表達(dá)，其中受低溫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子Psubgt;pyk/subgt;和Psubgt;pgds/subgt;的基因表達(dá)強(qiáng)度是在菌株常規(guī)培養(yǎng)溫度下的2倍，有助于實(shí)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌中目的基因的可控性表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及解淀粉芽孢桿菌來源的溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬模式生物，由于其快速的生長速率被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。又因其具有強(qiáng)大的蛋白分泌能力和是食品安全微生物的特點(diǎn)，解淀粉芽孢桿菌在酶制劑、代謝工程、抗體和飼料用菌制劑的生產(chǎn)領(lǐng)域也具有重要的應(yīng)用。但是，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，這些現(xiàn)有的工具已經(jīng)不能滿足研究者的需求。因此，為了更加快捷的對解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行基因改造，研究者開發(fā)了許多實(shí)用的基因調(diào)控表達(dá)工具。為擴(kuò)展解淀粉芽孢桿菌遺傳操作工具和拓展其應(yīng)用范圍，以往研究者對IPTG、木糖、四環(huán)素、蔗糖等化學(xué)物質(zhì)響應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行了深入研究，并將其應(yīng)用于嚴(yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。考慮到簡化操作的步驟和避免誘導(dǎo)劑的添加，一些響應(yīng)于特殊環(huán)境條件，如高pH、低溶氧、高溫和高滲透壓的新型啟動(dòng)子也開始應(yīng)用于表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。大多數(shù)的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵過程并不適合嚴(yán)苛的環(huán)境條件，構(gòu)建自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有更好的應(yīng)用前景。因此，在解淀粉芽孢桿菌中構(gòu)建新型的基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)具有重要的意義。溫度是微生物基礎(chǔ)研究和大規(guī)模發(fā)酵過程中的重要調(diào)節(jié)參數(shù)，因此，開展解淀粉芽孢桿菌溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的挖掘和功能研究可以豐富解淀粉芽孢桿菌的啟動(dòng)子文庫，為解淀粉芽孢桿菌分子生物學(xué)的研究提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明篩選獲得了在25～30℃表達(dá)強(qiáng)度更強(qiáng)的芽孢桿菌內(nèi)源啟動(dòng)子，可作為基因工程或代謝工程改造的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，具有如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.10任一所示的核苷酸序列，所述溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來源于保藏編號為CCTCC?NO:M2016346的解淀粉芽孢桿菌NX-2S，能夠啟動(dòng)在解淀粉芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)錄。

本發(fā)明還提供含有所述溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)元件。

本發(fā)明還提供含所述溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體能夠允許插入目的基因并使目的基因在細(xì)菌中表達(dá)。

本發(fā)明還提供含有所述表達(dá)元件或重組表達(dá)載體的微生物細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，所述微生物細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，所述細(xì)菌包括但不限于：大腸桿菌(Escherichia?coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)或解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)。

在一種實(shí)施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌NX-2S。

在一種實(shí)施方式中，所述微生物細(xì)胞是含所述重組表達(dá)載體的重組微生物細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，所述重組微生物細(xì)胞的宿主為解淀粉芽孢桿菌NX-2S。

本發(fā)明還提供調(diào)控目的蛋白表達(dá)量的方法，所述方法包括：將編碼目的蛋白的基因連接至所述溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，將含有所述基因的微生物在培養(yǎng)基中于合適的條件下培養(yǎng)，并在特定溫度下誘導(dǎo)所述溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。

在一種實(shí)施方式中，所述方法是將編碼目的蛋白的基因連接至SEQ?ID?NO.2所示的啟動(dòng)子P_gltA下游，將含有所述基因的微生物培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在25～42℃誘導(dǎo)所述溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。