[發明專利]一種用于檢測凝血酶活性及凝血酶抑制劑活性的熒光傳感器及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202210931602.3
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115197994A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 王冰;田蔣為;李子怡;喻謝安;王鐵杰;殷果;王玨
• 申請（專利權）人: 深圳市藥品檢驗研究院（深圳市醫療器械檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N21/64;C09K11/02
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 潘登

本發明提供了一種用于檢測凝血酶活性及凝血酶抑制劑活性的熒光傳感器及其制備方法與應用，所述熒光傳感器包括由聚集誘導發光探針與凝血酶發色底物交聯得到的納米顆粒。本發明提供的熒光傳感器制備簡單、反應條件溫和，且成本低廉，易于批量制備，既可用于檢測凝血酶活性又可用于凝血酶抑制劑活性的檢測，進而也可用于藥物中抗凝血組分的篩選，相較于現有技術的檢測或篩選方法而言具有成本低、簡單、快速、高效的優勢。

技術領域

本發明屬于生物傳感領域，涉及一種用于檢測凝血酶活性及凝血酶抑制劑活性的熒光傳感器及其制備方法與應用。

背景技術

COVID-19是由嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的病毒感染。研究報告顯示，幾乎所有重癥COVID-19患者傷口均出現凝血功能障礙并伴有血栓并發癥，靜脈血栓栓塞事件的發生率高達30％。凝血病發生在COVID-19患者和彌散性血管內凝血(DIC)和血栓性微血管病(TMA)。DIC的發病標志之一是凝血酶生成失調，這通常是由促炎細胞因子誘導的單核細胞和可能的內皮細胞上的組織因子表達的結果，最突出的是白細胞介素(IL)-6。

凝血酶，也稱為人α-凝血酶(因子IIa)，是一種球狀胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，其大小約為36千道爾頓(KD)，存在于常見的凝血途徑中。凝血酶是止血和血栓形成的關鍵蛋白。凝血酶是由其前體凝血酶原在凝血酶原復合物Xa因子的作用下酶促產生的，該復合物還包括磷脂、鈣和Va因子。在生理上，凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，最終導致血栓形成。凝血酶還激活因子XIII，然后交聯纖維蛋白以加強形成的凝塊。病理學上，凝血酶在血管損傷和各種病理活動中起重要作用，如血栓性疾病、動脈粥樣硬化和腫瘤等。同時，凝血酶可作為調節炎癥、動脈粥樣硬化和血栓形成的主要靶點。例如凝血酶可以激活PAR-4并在大鼠腸系膜靜脈中引起炎癥反應。PAR-4受體缺乏可激活血小板，減少微血管炎癥和腦缺血再灌注損傷。凝血酶還可以通過調節Rho激酶抑制劑的功效來改善動脈粥樣硬化并發癥。Gremmel等人發現血小板因子4、凝血酶原1和可溶性簇分化40配體是晚期動脈粥樣硬化的標志物，與凝血酶呈正相關。

目前，現有技術一般采用電化學方法或ELISA試劑盒來對凝血酶活性進行檢測，操作繁瑣而且試劑盒非常昂貴，因此如何開發一種成本低、簡單、快速、高效的凝血酶活性檢測方法成為本領域技術人員亟待解決的問題。

血必凈(XBJ)是一種中藥注射液，內含當歸、赤芍、川芎、紅花、丹參5種中藥成分，具有活血化瘀、通經通絡的作用，已被證明可有效治療COVID-19病例。XBJ具有拮抗氧化應激、抑制炎癥反應、調節免疫反應、改善凝血功能等現代藥理作用。Satoshi Gando等人發現控制凝血酶、纖溶酶和炎癥是改善COVID-19凝血功能障礙的關鍵。然而，血必凈中究竟是哪種或哪些成分具有抗凝血活性，來實現改善COVID-19凝血功能障礙的還未可知。

由于中藥成分復雜，可能包括上百種成分，因此在確定中藥療效的同時，本領域技術人員往往需要對中藥中的活性成分進行分析，來篩選出該中藥中發揮特定作用的具體成分。以抗凝血活性為例，目前現有技術一般首先通過柱層析、旋蒸等過程分離得到中藥中的不同組分，然后采用試劑盒法來篩選具有抗凝血活性的組分，一般通過檢測500nm左右的紫外吸收強度來反應組分的抗凝血活性。然而，一方面，柱層析等步驟操作復雜、耗時，而且對樣本量要求高(一般需要5毫克樣本才能實現活性檢測)，另一方面，中藥中的一些成分是有紫外吸收的，所以會造成干擾，導致檢測結果不準確。

因此，如何提供一種簡單、快速、靈敏度高的中藥抗凝血組分篩選方法成為了本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種用于檢測凝血酶活性及凝血酶抑制劑活性的熒光傳感器及其制備方法與應用。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：