[發明專利]一種提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法

在審

• 申請號: 202210930939.2
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115948442A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 陸文瑩;周嬋;錢婷婷;孔葉凱
• 申請（專利權）人: 杭州佳嘉樂生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12P17/18;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 程武紅

本發明提供了一種提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法，屬于植物基因改造技術領域。所述方法包括以下步驟：首先通過基因測序的方法從鐵皮石斛葉中選擇合適的基因；然后選擇合適的內切酶將目的基因剪切下來，并選擇合適的連接酶將目的基因鏈接至感受態細胞中觀察其表達情況；隨后將目的基因通過連接酶鏈接至載體上并將載體轉移至植物乳桿菌中；最后采用改造后的植物乳桿菌發酵石斛莖，從而得到生物堿含量高的發酵原漿。本發明從石斛葉中篩選出生物堿合成的關鍵酶基因，且通過基因改造的方式將其轉移至植物乳桿菌中并得以表達；該改造菌種可以用于石斛發酵，且發酵原漿中生物堿含量大大提高。

技術領域

本發明涉及植物基因改造技術領域，尤其是涉及一種通過基因改造技術提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法。

背景技術

生物堿是存在于自然界(主要為植物，但有的也存在于動物)中的一類含氮的堿性有機化合物，有似堿的性質，所以過去又稱為贗堿。大多數有復雜的環狀結構，氮素多包含在環內，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一，具有光學活性。不同的生物堿有不同的功效和作用。

鐵皮石斛為古代本草中最早能確定的石斛品種，是藥用石斛主流品種之一。石斛主要含有生物堿類、多糖類、黃酮類、酚類等多種化學成分，其中生物堿為其主要藥理活性成分，具有降血糖、改善記憶、保護神經、抗白內障、抗腫瘤等藥理作用。

目前對于石斛中生物堿的提取方法主要有非極性溶劑提取如氯仿、乙醚等，但該方法不能提出水溶性生物堿；極性溶劑提取如乙醇、甲醇等，但該方法提取的生物堿中雜質較多，較難分離純化；熱回流提取，但該方法一次處理的樣品較少且需要大量溶劑，雖提取的產品質量較好但不適合批量生產且溶劑浪費較大。

目前雖已有文獻推測了石斛本身合成生物堿的機理，但是由于石斛堿的結構復雜，且石斛基因組龐大，證明作為可能中間體的代謝產物含量低、不易與其他代謝物分離，故石斛堿的生物合成機理還停留在推測層面，涉及到的相關基因和合成生物堿的關鍵酶的報道很少。

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，最適生長溫度為30～35℃，厭氧或兼性厭氧，菌種為直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀，最適pH?6.5左右，屬于同型發酵乳酸菌。植物乳桿菌具有很多的保健作用，①有一定的免疫調節作用；②對致病菌有抑制作用；③降低血清膽固醇含量和預防心血管疾病；④維持腸道內菌群平衡；⑤促進營養物質吸收；⑥緩解乳糖不耐癥；⑦抑制腫瘤細胞的形成等。

雖然植物乳桿菌常用于生物堿的發酵和提取，但是由于植物乳桿菌中無石斛堿合成相關基因和相關酶，導致利用植物乳桿菌發酵的石斛莖發酵液中石斛堿的含量極低，只有水作為溶劑溶解的微量石斛堿存在與發酵液中，因此亟需開發一種利用基因提取技術將合成生物堿的相關基因移植到植物乳桿菌中從而增加發酵液中石斛堿的含量的方法。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法。本發明從石斛葉中篩選出生物堿合成的關鍵酶基因，且通過基因改造的方式將其轉移至植物乳桿菌中并得以表達；該改造菌種可以用于石斛發酵，且發酵原漿中生物堿含量大大提高。

本發明的技術方案如下：

一種提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法，包括以下步驟：

(1)通過基因測序的方法從石斛葉中選擇適用于制備生物堿的目的基因；

(2)采用內切酶將目的基因剪切下來，并使用連接酶將目的基因連接至感受態細胞中觀察其表達情況，確認表達成功后將帶有目的基因的質粒轉移至植物乳桿菌中；

(3)目的基因質粒鏈接成功后，將質粒轉移至植物乳桿菌，得到重組植物乳桿菌；將重組植物乳桿菌接種至MRS固體平板分離純化，得到改造后的植物乳桿菌菌種；

(4)將改造后的植物乳桿菌菌種和干燥的石斛莖粉末混合，加入純凈水進行發酵，發酵結束后進行過濾，得到含有生物堿的發酵原漿。