[發明專利]一種提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法

在審

• 申請號: 202210930939.2
• 申請日: 2022-08-04
• 公開（公告）號: CN115948442A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 陸文瑩;周嬋;錢婷婷;孔葉凱
• 申請（專利權）人: 杭州佳嘉樂生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12P17/18;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 程武紅

1.一種提高植物發酵原漿中生物堿含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)通過基因測序的方法從石斛葉中選擇適用于制備生物堿的目的基因；

(2)采用內切酶將目的基因剪切下來，并使用連接酶將目的基因連接至感受態細胞中觀察其表達情況，確認表達成功后將帶有目的基因的質粒轉移至植物乳桿菌中；

(3)目的基因質粒鏈接成功后，將質粒轉移至植物乳桿菌，得到重組植物乳桿菌；將重組植物乳桿菌接種至MRS固體平板分離純化，得到改造后的植物乳桿菌菌種；

(4)將改造后的植物乳桿菌菌種和干燥的石斛莖粉末混合，加入純凈水進行發酵，發酵結束后進行過濾，得到含有生物堿的發酵原漿。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的操作過程包括如下步驟：

A1：稱量3份鐵皮石斛葉粉末，每份1.000g，分別加甲醇、體積分數85-95％的乙醇、氯仿30-50mL，超聲、過濾，取續濾液25mL，減壓回收至干，加甲醇1mL溶解，過0.4-0.5μm的濾膜過濾后裝2mL進樣瓶，作為樣品溶液待用；

A2：稱取石斛堿標準品15.45mg，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為3090mg/L的石斛堿標準品母液；

A3：精密量取1mL標準品母液，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液備用；所述對照品溶液質量濃度為123.6mg/L；

然后分別量取質量濃度為3090mg/L的石斛堿標準品母液0.1mL、0.2mL、0.4mL、1mL、2mL，各置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；各取1.5mL過0.4-0.5μm的濾膜過濾后裝2mL進樣瓶，作為標準品溶液備用；

A4：使用Waters?RP18柱，流動相為乙腈-水-三乙胺溶液，熒光檢測器激發波長為200-230nm，流速0.8-1.2mL/min，柱溫為20-30℃，進樣體積為15-25μL；

A5：將步驟A3中配置好的質量濃度為123.6mg/L的對照品溶液按步驟A4中的色譜條件檢測；

然后將步驟A3中配置好的不同濃度的標準品溶液按步驟A4中的色譜條件檢測，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線；

隨后將步驟A1中處理好的石斛葉樣品溶液按步驟A4中的色譜條件檢測，對照對照品溶液色譜圖確定樣品色譜圖中是否出現石斛生物堿的峰值；

A6：如果樣品溶液的色譜圖中出現石斛生物堿的峰值與標品，則對石斛葉進行基因測序，找尋產生生物堿的相應基因序列；如果未出現峰值，則更換樣品為鐵皮石斛花或其他部位，重復步驟A1-A6；

A7：使用植物基因組DNA提取試劑盒提取石斛葉DNA，并使用不同限制性核酸內切酶進行酶切，然后使用電泳儀檢測其結果；電泳結果為：石斛葉DNA可以使用限制性內切酶EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI酶切，獲得DNA條帶；

A8：將提取出的DNA樣品用FastStart?Essential?DNA?Green?Master試劑盒處理后，放入實時熒光定量PCR儀中進行循環；重復實驗三次確認生物堿合成的關鍵酶基因；

A9：對步驟A8中的基因采用BLAST算法，由算法得出的結果得到穩定的適用于制備生物堿的目的基因，所述目的基因的片段序列ID為c83396_g1。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的操作過程包括如下步驟：

B1：將步驟A9中選中的目的基因序列通過EcoRI核酸內切酶進行雙酶切剪切下來，酶切位點為5`AATTC、CGAAC-3`；

B2：使用T4連接酶將剪切后的目的基因DNA連接至DH5α感受態細胞中，將細胞涂布于含有卡那霉素的LB固體培養基上，37℃培養過夜；然后挑取白色單菌落于LB液體培養基中37℃培養16h，進行PCR驗證，并提取質粒進行雙酶切驗證，PCR產物和雙酶切產物用電泳檢測；

B3：按照步驟A7的方法提取植物乳桿菌DNA，并對其采用限制性內切酶EcoRI進行酶切；酶切后電泳檢測結果為限制性內切酶EcoRI可以對植物乳桿菌DNA進行酶切；

B4：電泳實驗結束后，使用限制性內切酶EcoRI對植物乳桿菌DNA進行雙鏈酶切并使用T4連接酶將步驟A9中的目的基因連接至酶切處；連接完成后對重組質粒進行DNA測序，確定目的基因與改造基因組連接成功。