[發明專利]一種臍帶血紅細胞凍存方法

在審

• 申請號: 202210926670.0
• 申請日: 2022-08-03
• 公開（公告）號: CN115386549A
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 薛曉鋒;王迎耀;閔博;袁鴻梅;韋丹;朱學義
• 申請（專利權）人: 河南省遺傳資源細胞庫有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;A01N1/02
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 葉立劍

1.一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：包括以下步驟

步驟一、臍帶血篩選：臍帶血來自醫院足月妊娠健康產婦，產前檢查乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人類免疫缺陷病病毒、巨細胞病毒、EB病毒等均陰性，產婦及家屬對臍帶血用于實驗研究均知情同意；

步驟二、標本前處理：標本表面的消毒處理，目的是去除表面污漬，和可能的細菌進入血液中；

步驟三、沉降并分離紅細胞：臍帶血標本中加入羥乙基淀粉，羥乙基淀粉可與紅細胞膜上的負電荷結合，使紅細胞凹面相貼體積增大而使得沉降速度加快，利用紅細胞和白細胞的沉降速度的差異來實現分離紅細胞；

步驟四、凍存：將一定比例的凍存液，加入步驟三得到的紅細胞中；

步驟五、程控降溫：將步驟四獲得的紅細胞制劑防止程控降溫盒中，執行程序降溫程序，從室溫降至-80℃，制備成冰凍紅細胞制劑；

步驟六、復蘇解凍：將深低溫保存一定時間的冰凍紅細胞制劑進行快速復溫；

步驟七、紅細胞檢測：將步驟六中復溫的紅細胞制劑進行血紅蛋白、紅細胞平均體積、紅細胞滲透脆性試驗、紅細胞免疫功能檢測。

2.根據權利要求1所述的一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：所述步驟二中，臍帶血標本先標記，再用熱合機對采集管進行熱合并稱重，將標本采集袋放入84消毒液充分浸泡10-20分鐘，然后用75%酒精擦拭消毒后放置4℃冰箱中，通過傳遞窗傳至凈化車間進行處理。

3.根據權利要求1所述的一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：所述步驟三中，臍帶血標本按照臍帶血量：羥乙基淀粉=4：1加入所需羥乙基淀粉量，無菌操作下，將HES注入臍帶血袋，用止血鉗夾住針孔部位，然后用熱合機封管，搖床500prm/min充分混勻10min，置4℃條件下，靜置30min后，離心500rpm、7min，大致分為三層，上層血漿，中層干細胞，下層紅細胞，夾緊150ml轉移袋的止血夾，緩慢的將干細胞及血漿擠壓至另外一個250ml轉移袋，殘留于母袋中的紅細胞進行后續處理。

4.根據權利要求1所述的一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：所述步驟四中，獲取的紅細胞加入凍存液，凍存液中加入0.3M海藻糖，15%右旋糖酐，12.25%HES，得到紅細胞制劑。

5.根據權利要求1所述的一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：所述步驟五中，得到的紅細胞制劑利用程序降溫降溫，4℃等待，紅細胞制劑放入程序降溫儀；以5℃/min降至0℃，保持5min；以2℃/min降至-10℃，保持5min；以1℃/min降至-45℃，保持35min；以5℃/min降至-90℃，保持5min，程序結束后，制成冰凍紅細胞制劑，將其放置-80℃冰箱中。

6.根據權利要求1所述的一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：所述步驟六中，將深低溫保持3、6個月的冰凍紅細胞制劑取出，立即在38～43℃恒溫水浴槽中1-2min內快速復溫。

7.根據權利要求1所述的一種臍帶血紅細胞凍存方法，其特征在于：所述步驟七中，將快速復溫的紅細胞制劑進行各種紅細胞的檢測：分別進行血紅蛋白、紅細胞平均體積、紅細胞滲透脆性試驗、紅細胞免疫功能檢測采用流式雙抗的方法進行紅細胞平均熒光強度測定，一抗鼠抗人紅細胞CR1，二抗使用羊抗鼠IgG-FITC，流式上機檢測。