[發明專利]一種基于uPA的GFD結構域構建的嵌合抗原受體免疫細胞制備及其應用

在審

• 申請號: 202210923323.2
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN116199787A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 趙旭東;何帥
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

本發明提供了一種基于uPA的生長因子樣結構域(GFD)構建的嵌合抗原受體免疫細胞制備及其應用。具體地，本發明提供了一種基于GFD改造的嵌合抗原受體(CAR)，所述的CAR含有一胞外結合域，所述的胞外結合域能夠特異性地靶向GFD結合蛋白(包括uPAR)。本發明的CAR免疫細胞具有較強的特異性和較適宜的靶點親和力，因此對靶細胞的殺傷能力較強且安全性高。

技術領域

本發明屬于腫瘤免疫治療生物醫藥技術領域，涉及特異性嵌合抗原受體免疫細胞，具體涉及一種特異性靶向GFD結合蛋白的嵌合抗原受體、其修飾的免疫應答細胞、及其制備方法和應用。

背景技術

嵌合抗原受體T細胞療法(CAR-T)是體外人為地改造T細胞，使T細胞具有靶向性，然后再將其回輸至患者體內，特異性殺傷腫瘤細胞的一種免疫療法。在CAR-T療法中，CAR工程改造的T細胞將抗體的特異性與T細胞的歸巢和殺傷能力結合在一起，特異性發揮效應。此外，也可將其他特征修飾(如遷移，體內穩態增殖，抑制抗性等)嵌入到CAR-T細胞中，使其能更好地發揮效應。

尿激酶型纖溶酶原激活受體(uPAR)是一種GPI錨定的細胞膜受體，由三個同源結構域(DI，DII，DIII)組成，其主要功能是激活尿激酶(uPA)蛋白水解活性，調節細胞外基質(ECM)組分降解。uPA酶原和uPA都能結合uPAR，uPAR的一部分在與配體結合時被蛋白酶水解切割，產生可溶性uPAR(suPAR)。有大量文獻證明了uPAR在大多數腫瘤進展中的重要性，在大多數的腫瘤細胞和腫瘤基質中過表達，包括乳腺癌，結直腸癌，前列腺癌，胰腺癌，卵巢癌，肺癌和膠質瘤等實體瘤，以及急性白血病和骨髓瘤等血液系統惡性腫瘤。然而正常組織僅在胸骨上皮中、單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞的亞群檢測到低uPAR表達。研究表明，(1)uPAR表達升高與不同類型癌癥患者的不良結局(侵襲、轉移和復發)有關；(2)uPAR與腫瘤代謝密切相關；(3)uPAR表達與非小細胞肺癌(NSCLC)和結直腸癌(CRC)患者的RAS基因突變相關；(4)uPAR是調節腫瘤細胞休眠和增殖之間轉變的關鍵參與者；(5)uPAR與腫瘤細胞的多藥耐藥性(MDR)有關；(6)uPAR與腫瘤血管生成有關。

衰老(aging)是受遺傳和環境因素共同影響的復雜過程，與永久性、漸進性的生理細胞衰退密切相關，是導致人口老齡化日漸嚴重的原因之一。衰老能夠顯著提高機體的患病率，即衰老相關疾病，如糖尿病、阿爾茨海默癥、心血管疾病及神經退行性疾病等。個體衰老與衰老細胞既有聯系，但又完全不同。衰老細胞是細胞處于穩定的細胞周期阻滯和分泌調節組織微環境的相關細胞因子。在生理上，衰老細胞是一種抑制腫瘤的機制，可以阻止癌前細胞的擴張，并在傷口愈合反應中發揮有益的作用。隨著個體衰老，組織內會積累衰老細胞。衰老細胞在老年個體組織中的比例很少，但衰老細胞的積累會促進個體衰老及產生炎癥環境、導致慢性組織損傷，如肝和肺纖維化、動脈粥樣硬化、糖尿病和骨關節炎等疾病。在老年個體中消除衰老細胞可以改善這些病理癥狀，甚至促進長壽。已有研究證實，uPAR是細胞衰老的重要表面標志物，并且衰老細胞可分泌可溶性uPAR(suPAR)、作為衰老相關分泌表型(SASP)的一部分。

鑒于uPAR在腫瘤和衰老發生發展中的重要作用，已經有大量的研究探究uPAR在腫瘤和衰老，以及衰老相關疾病的診斷、預后方面的作用；以及將uPAR作為惡性腫瘤、衰老和衰老相關疾病的治療靶標，探究靶向uPAR在相關治療中的作用。

uPA蛋白含有N端的ATF結構域(Amino-Terminal?Fragment)和C端的催化結構域，ATF結構域又可分為兩個小的結構單元：GFD(Growth?Factor-like?Domain)和Kringle結構域。雖然GFD結構域是uPA結合uPAR所必需的，但已有研究多采用ATF來研究uPA與uPAR的結合，以及用ATF結構域和EGF(epidermal?growth?factor)構建雙特異性抗體靶向EGFR和uPAR、用ATF結構域構建靶向uPAR的CAR-T。ATF中的Kringle結構域可與其他蛋白如整合素(integrins)等結合，可能導致T細胞殺死整合素陽性的細胞，產生副作用。更小的GFD結構域是否能用于構建CAR-T并不清楚。