[發明專利]一種對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法

在審

• 申請號: 202210922860.5
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN115558677A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 劉建華;楊支力
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/78;C12N1/21;C12R1/385
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 施雨婧

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法。本發明通過敲除質粒同源重組、插入回補質粒以及環出敲除質粒三步法方案來構建基于自殺質粒的細菌必需基因的缺失突變菌株。利用該方法，以銅綠假單胞菌PA0006基因作為目的基因，團隊詳細研究了假單胞菌必需基因PA0006的功能與抑制分析，結合顯微觀察、免疫印跡、轉錄組測序與DNA重測序等技術發現PA0006在細胞形態和脂多糖核心寡糖的生物合成中發揮著調節作用。PA0006基因也是開發治療和預防銅綠假單胞菌引起疾病的新藥靶標。與現有技術對比，本發明簡單、快速、有效，方法可廣泛應用于細菌必需基因的表型和抑制分析。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法。

背景技術

微生物必需基因是那些在豐富培養基中編碼細胞生長不可缺少的功能的基因。轉座子插入測序(Tn-seq)技術允許在微生物基因組水平上通過插入排除來鑒定必需基因，目前通過使用Tn-seq方法，已經在銅綠假單胞菌PAO1中提出了近350個必需基因，對銅綠假單胞菌的必需基因進行了全面的基因組研究，為挖掘細胞生長所必需的新生物過程和新藥開發的目標提供了資源。然而這些必需基因的抑制性分析尚未完成，350個必需基因中超過15.7％被歸類為編碼假設蛋白或保守假設蛋白，現有技術中缺乏構建銅綠假單胞菌必需基因條件等位基因型的系統方法。

可調控的啟動子，如依賴阿拉伯糖的P_BAD啟動子和雜合的trp-lac啟動子P_tac，常通過控制它們的轉錄水平用于必需基因的分析。最近，利用dead-Cas9(dCas)介導的抑制靶基因轉錄的CRISPR干涉(CRISPRi)技術已被報道用于大規模研究枯草芽孢桿菌和肺炎鏈球菌的必需基因。然而，CRISPRi介導的突變體傾向于在dCas9中積累突變，導致長時間生長后轉錄抑制缺失。因此，轉錄調控介導的突變不適合用于必需基因的抑制因子分析。

授權公告號為CN109777830B、授權公告日為2022年5月20日的中國專利公開了一種在細胞系中條件性敲除必需基因的方法，構建雙質粒系統：敲除質粒(KO質粒)和營救質粒(Rescue質粒)，將兩個質粒同時轉入細胞后用藥篩若干天，分選單克隆，通過測序鑒定，獲得必需基因純合敲除細胞系。許多必需基因在酵母中被發現是可抑制的。通過使用互補質粒的條件致死基因，必需基因抑制性的系統分析已經鑒定出7-17％的必需基因在酵母中是可抑制的。酵母中必需基因的缺失等位基因可以在二倍體細胞中構建成有活力的雜合子。引入回補質粒后，誘導雜合二倍體細胞形成孢子，產生單倍體孢子或含有帶有回補質粒的缺失等位基因的細胞。然而，這些方法不適用于細菌細胞。

發明內容

為了解決現有技術中缺乏對必需基因進行反向遺傳分析的方法的技術問題，本發明提出了一種對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的方法。本發明簡單、快速、有效，能達到對細菌中必需基因進行反向遺傳分析的效果。

本發明的具體技術方案為：

第一方面，本發明提供了一種對必需基因進行反向遺傳分析的方法，包括以下步驟：

(1)向細菌細胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除質粒，篩選出敲除質粒通過單交換同源重組整合到細菌細胞染色體中的細菌細胞；

(2)轉化含有目的基因自身啟動子及其控制的野生型等位基因片段的回補質粒，篩選出含有回補質粒的細菌細胞；

(3)通過環出效應切除細菌細胞基因組中的部分片段，而后篩選出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的細菌細胞；

(4)對缺失突變體細胞控制表達并觀察表型，進行表型評估和抑制性分析。

作為優選，所述方法具體包括以下步驟：